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HTRF (H/M) CDK1 P-T14 KIT - 10K PTS

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概述

这种基于 HTRF 的细胞检测方法可便捷且准确地检测苏氨酸 14（Thr14）位点磷酸化的细胞周期蛋白依赖性激酶 1（CDK1）。

细胞周期蛋白依赖性激酶 1（CDK1）是协调哺乳动物细胞周期进程的 CDK 亚家族成员（该亚家族还包括 CDK1、CDK4 和 CDK6）。CDK1 是一种名为 M 期促进因子的蛋白激酶的催化亚基，该因子可诱导细胞进入有丝分裂期。CDK1 通过与多种间期细胞周期蛋白（周期蛋白 A、周期蛋白 B）结合，促进 G2 期到 M 期的转换，并调控 G1 期进程及 G1 期到 S 期的转换。Wee1 和 Myt1 蛋白激酶可使 CDK1 的 Thr14 和酪氨酸 15（Tyr15）位点发生磷酸化，从而抑制 CDK1 的活性。cdc25 磷酸酶可能负责去除 Thr14 和 Tyr15 位点的磷酸基团，进而激活 CDK1。

Thr14 位点的 CDK1 抑制性磷酸化对于维持基因组完整性以及防止 S 期 DNA 损伤至关重要。因此，Wee1/cdc25A 轴成为癌症治疗的一个极具吸引力的靶点，并且可能代表了一种使具有过度活跃 CDK1 的癌细胞敏感化的独特方法。

工作原理

磷酸化 CDK1（Thr14）检测原理

磷酸化 CDK1（Thr14）检测用于测量 Thr14 位点磷酸化的 CDK1。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。该检测使用两种抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选，可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，并能在免洗涤的检测形式下为评估蛋白质的磷酸化状态提供手段。

human-and-mouse-phospho（人源和鼠源磷酸化示意图）

磷酸化 CDK1（Thr14）双板检测方案

双板方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后添加磷酸化 CDK1（Thr14）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

human-and-mouse-phospho-2.svg（人源和鼠源磷酸化 - 2 示意图）

磷酸化 CDK1（Thr14）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测 Thr14 位点磷酸化的 CDK1 可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中完成。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 质量。

human-and-mouse-phospho-3.svg（人源和鼠源磷酸化 - 3 示意图）

检测验证

使用羟基脲调节磷酸化 CDK1（Thr14）

将 HeLa 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）培养 6 小时，然后用浓度递增的羟基脲（单链断裂诱导剂）处理过夜。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）或总 CDK1 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，羟基脲引发 Thr14 位点磷酸化的 CDK1 呈剂量依赖性增加，而该蛋白质的表达水平未受此处理的调控。

human-and-mouse-phospho（人源和鼠源磷酸化示意图）

使用 Wee1/Myt1 抑制剂调节磷酸化 CDK1（Thr14）

将 HeLa 和 MCF7 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）培养 24 小时，然后用 Wee1/Myt1 激酶抑制剂 PD0166285 处理 2 小时。

细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）或总 CDK1 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，Wee1/Myt1 激酶抑制剂 PD166285 降低了 Thr14 位点磷酸化的 CDK1 水平，而该蛋白质的表达水平保持稳定。

human-and-mouse-phospho-5.svg（人源和鼠源磷酸化 - 5 示意图）

human-and-mouse-phospho（人源和鼠源磷酸化示意图）

通过 siRNA 敲低实验验证磷酸化 CDK1（Thr14）检测的特异性

将 HeLa 细胞接种到 96 孔板中（10,000 个细胞 / 孔）并培养 24 小时。然后用针对 CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5 或 CDK6 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后，裂解细胞。将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，转染 CDK1 siRNA 的细胞信号降低了 72%。相反，敲低 CDK2、CDK3、CDK4、CDK5 或 CDK6 并未导致信号降低，这表明 HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）检测对 CDK1 的磷酸化具有特异性，且不会与其他细胞周期 CDK 家族成员发生交叉反应。

human-and-mouse-phospho（人源和鼠源磷酸化示意图）

多种细胞系中磷酸化 CDK1（Thr14）水平的评估

将贴壁的人源和鼠源细胞（HeLa、MCF7 和 Neuro 2A 细胞）或悬浮细胞（如 THP1 细胞）以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用补充的裂解缓冲液裂解细胞，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）检测能有效检测多种表达不同水平该蛋白的细胞模型中的磷酸化 CDK1（Thr14）。

human-and-mouse-phospho（人源和鼠源磷酸化示意图）

HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）检测与蛋白质印迹法的比较

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，用 3mL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）检测试剂。使用等量的裂解物对 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行比较。

使用 HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）检测时，625 个细胞 / 孔就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法则需要 20,000 个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）检测的灵敏度是蛋白质印迹技术的 32 倍。

human-and-mouse-phospho（人源和鼠源磷酸化示意图）

简化通路

磷酸化 CDK1 在细胞分裂周期中的作用

细胞周期蛋白依赖性激酶 1（CDK1）是协调哺乳动物细胞周期进程的 CDK 亚家族成员（该亚家族还包括 CDK2、CDK4 和 CDK6）。

有丝分裂原信号（如生长因子）通过诱导周期蛋白 D 的合成，触发细胞进入细胞周期的 G1 期，进而形成有活性的 CDK4/6 - 周期蛋白 D 复合物。CDK4 和 CDK6 使视网膜母细胞瘤（RB）蛋白发生单磷酸化，此时 RB 仍与转录因子 E2F 结合，但部分基因可被转录，如周期蛋白 E。在 G1 期晚期和 S 期早期，周期蛋白 E 与 CDK2 相互作用并激活 CDK2，CDK2 进而磷酸化 RB 上的其他位点，导致其完全失活。因此，S 期进程所需的 E2F 应答基因被诱导表达，如周期蛋白 A，随后周期蛋白 A 与 CDK2 相互作用形成周期蛋白 A/CDK2 复合物。激活的 CDK2 最终磷酸化 Cdc25B 和 Cdc25C 磷酸酶，这些磷酸酶进而激活 CDK1，而 CDK1 是细胞分裂周期中 G2 期和 M 期进程（中心体成熟与分离、染色体凝缩以及核膜破裂后的有丝分裂进入）所必需的。

phospho-pathway-Phospho-CDK1-Thr14.svg（磷酸化通路 - 磷酸化 CDK1-Thr14 示意图）

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64CDK1T4PEH

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