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HTRF TBK1 TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

总 TBK1（总 TANK 结合激酶 1）细胞检测试剂盒旨在监测 TBK1 蛋白（包括磷酸化型和非磷酸化型）的表达水平。该试剂盒可与我们的磷酸化 TBK1 试剂盒兼容，能够从同一份样本中分析磷酸化蛋白与总蛋白，从而更准确地解读 T 细胞活化情况。在病原体感染后，TBK1 可被细菌脂多糖（LPS）和病原体核酸激活，而这些物质会进一步触发 TLR3/4（Toll 样受体 3/4）和 cGAS-STING（环 GMP-AMP 合成酶 - 干扰素基因刺激蛋白）信号轴的激活。

工作原理

总 TBK1 检测原理

总 TBK1 检测可对细胞裂解液中 TBK1 的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板开展，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 TBK1 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 TBK1 蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 TBK1 时，加入这些偶联抗体后，供体荧光团会与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中 TBK1 蛋白的浓度直接成正比，且在免清洗检测模式下，可用于评估蛋白的表达水平。

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总 TBK1 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板后，加入总 TBK1 HTRF（均相时间分辨荧光）检测试剂。该方案能够监测细胞的存活率和融合度。

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总 TBK1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 TBK1 时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需清洗步骤。该方案专为高通量筛选（HTS）设计，可在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

phospho-how-it-works-total-tbk1-1-plate-assay-protocol

检测验证

通过总 TBK1 分析监测库普弗细胞中 LPS/TLR4 信号轴的活性

将小鼠库普弗细胞（ImKC 细胞系）以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到含完全培养基的 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。次日，用在无血清培养基中稀释且浓度递增的 LPS 处理细胞 1 小时。移除培养基后，加入 50μL 补充后的 4 号裂解缓冲液，在室温（RT）下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟；取 16μL 裂解液分两次转移至小体积白色微孔板中，再加入 4μL HTRF® 磷酸化 TBK1 或总 TBK1 检测抗体。在室温下孵育过夜后，记录 HTRF 信号。结果显示，LPS 可诱导 TLR4 信号激活，使 TBK1 的丝氨酸 172（Ser172）位点磷酸化水平提升 3 倍，而该激酶的表达水平保持稳定，表明 LPS 不会产生细胞毒性作用。

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通过总 TBK1 分析监测 cGAS-STING 通路的激活情况

将小鼠库普弗细胞（ImKC 细胞系）以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到含完全培养基的 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。次日，用在无血清培养基中稀释且浓度递增的 23 - 环磷酸鸟苷 - 腺苷（23-cGAMP）处理细胞 1 小时。移除培养基后，加入 50μL 补充后的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟；取 16μL 裂解液分两次转移至小体积白色微孔板中，再加入 4μL HTRF® 磷酸化 TBK1 或总 TBK1 检测抗体。在室温下孵育过夜后，记录 HTRF 信号。结果显示，用 23-cGAMP 处理细胞可激活 STING，进而使 TBK1 的 Ser172 位点磷酸化水平提升 3.6 倍，且该激酶的表达水平如预期保持稳定。

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HTRF 磷酸化 TBK1 与总 TBK1 细胞检测试剂盒与蛋白质印迹法（Western Blot）的比较

将人宫颈癌 HeLa 细胞系接种到含完全培养基的 T175 培养瓶中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 2 天，直至细胞融合度达到 90%。随后，用 200nM 花萼海绵诱癌素 A（Calyculin A）处理细胞 10 分钟，再加入 3mL 补充后的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后，收集可溶性上清液。用补充后的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16μL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4μL HTRF® 磷酸化 TBK1 或总 TBK1 检测抗体。取等量裂解液，采用 HTRF 检测与 Western Blot 进行平行对比。结果显示，使用 HTRF® 磷酸化 TBK1 或总 TBK1 试剂盒时，每孔仅需 1,250 个细胞即可检测到显著信号；而使用 Western Blot 检测最低化学发光（ECL）信号时，需 2,500 个细胞。因此，HTRF 检测的灵敏度是 Western Blot 技术的 2 倍。

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简化通路

TLR3/4 与 cGAS-STING 简化通路

TBK1（TANK 结合激酶 1，又称 NAK）是一种多聚体激酶，通过丝氨酸 172（Ser172）位点的自身磷酸化实现激活。该激酶是连接多条通路（涉及炎症和自噬）的关键信号节点。在病原体感染后，TBK1 可被细菌脂多糖（LPS）和病原体核酸激活，这些物质会进一步触发 TLR3/4 和 cGAS-STING 信号轴的激活。

当 LPS 在细胞表面与 TLR4 结合后，TLR4 会转移至内体并招募 TRAM 蛋白，TRAM 蛋白进而激活 TRIF 蛋白；同理，进入细胞的双链 RNA（dsRNA）会与内体中的 TLR3 结合，直接激活 TRIF 蛋白。对于双链 DNA（dsDNA），其进入细胞后会与胞质中的传感器 cGAS 结合，诱导生成 23-cGAMP，23-cGAMP 再激活衔接蛋白 STING。

上述每条通路激活后，TBK1 会被招募到不同的信号复合物中，并通过 Ser172 位点的自身磷酸化实现激活。激活后的 TBK1 会进一步激活转录因子 IRF3（干扰素调节因子 3），IRF3 转移至细胞核内并诱导 I 型干扰素（IFN）基因表达，最终引发炎症反应。此外，TBK1 还参与自噬过程，它可直接磷酸化自噬受体视神经萎缩蛋白（optineurin）和 p62 蛋白，这些受体能将蛋白 cargo（待降解蛋白）靶向运送到自噬体中。

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规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号通路研究
品牌：HTRF
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：总蛋白
产品类别：试剂盒
样本体积：16μL
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人、小鼠
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：10,000 次检测

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货号：64NTBPEH

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