产品概述

亨廷顿蛋白（HTT）是一种在大脑中高表达的细胞质蛋白，其抗凋亡作用对神经元存活至关重要。野生型（WT）HTT 蛋白具有功能结构，其 “正常” 的多聚谷氨酰胺（polyQ）结构域含有的谷氨酰胺残基（Q）少于 36 个。突变型 HTT 蛋白含有异常延长的多聚谷氨酰胺链（>36 个 Q），导致该蛋白失去功能并发生聚集。HTT 聚集会引发选择性神经元死亡，这是亨廷顿舞蹈症的致病原因。

工作原理

总 HTT 检测原理

总 HTT 检测基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）双抗夹心免疫分析技术，涉及两种特异性抗体：一种标记铽离子穴状化合物（Tb³⁺ cryptate，供体），另一种标记 d2（受体）。两种抗体均能结合可溶性总 HTT（野生型和突变型），供体与受体的近距离接触会产生荧光 TR-FRET 信号。信号强度与样本（细胞裂解液或组织裂解液）中可溶性总 HTT 的浓度直接成正比。（图示：human-mouse-total-huntingtin-detection-kit，总 HTT 检测原理相关图示）

总 HTT 检测方案

该检测可在 96 孔或 384 孔低体积白色检测板中进行，最终反应体积为 20 微升。操作流程如下：将样本（细胞 / 组织裂解液）或标准品直接加入检测板，使用 HTRF 试剂检测总 HTT。标记 HTRF 荧光团的抗体可预先混合，通过单次加样步骤加入，无需洗涤步骤。通过按比例调整各试剂的添加体积，可进一步实现实验的微型化或规模化扩展。（图示：human-mouse-total-huntingtin-detection-kit，总 HTT 检测方案相关图示）

检测详情

技术参数

• 样本量：10 微升（µL）
• 最终检测体积：20 微升（µL）
• 出结果时间：室温下过夜（Overnight at RT）
• 试剂盒组分：冷冻对照裂解液、检测抗体、缓冲液及实验方案
• 2 号裂解缓冲液中的检测限（LOD）与定量限（LOQ）：1.6 ng/mL 与 6.3 ng/mL
• 检测范围：6.3–750 ng/mL
• 物种交叉反应性：人、小鼠、大鼠
• 检测特异性：可溶性野生型和突变型 HTT 形式

检测验证

野生型和突变型 HTT 小鼠模型脑组织结构样本分析

使用症状前 zQ175 小鼠及其野生型同窝小鼠（目前研究最广泛的亨廷顿舞蹈症临床前敲入小鼠模型，参考文献：Landles C. 等，《Brain Commun.》2021; 3 (1):fcaa231）的脑组织验证该 HTRF 总 HTT 检测。按照试剂盒说明书流程裂解 3 只野生型小鼠（#1、#2、#3）和 3 只突变型 zQ175 小鼠（#4、#5、#6）的大脑皮层和小脑组织：用添加蛋白酶抑制剂的冰浴 1X 2 号裂解缓冲液制备 5%（w/v）组织匀浆，离心去除含潜在突变型 HTT 聚集物的不溶性组分，取含可溶性 HTT 蛋白的上清液，分别使用 HTRF 总 HTT 检测试剂盒和 HTRF 突变型 HTT 检测试剂盒（货号 64HTTMPEG/H）进行分析。为验证各样本蛋白提取效率一致，同时使用 HTRF GAPDH 检测试剂盒（货号 64GAPDHPEG/H）检测管家蛋白 GAPDH 的水平。为确保检测物浓度处于各试剂盒的线性范围内，检测前将裂解液用添加蛋白酶抑制剂的 1X 2 号裂解缓冲液预稀释（总 HTT 检测稀释 1/4，突变型 HTT 检测稀释 1/8，GAPDH 检测稀释 1/100）。结果显示：所有样本的 GAPDH 水平相近（绿色柱形），表明组织裂解液的总蛋白含量一致。野生型小鼠样本的突变型 HTT 检测未出现信号，而症状前 zQ175 小鼠的皮层和小脑组织中可清晰检测到可溶性突变型蛋白（蓝色柱形）。如预期所示，所有裂解液中均检测到可溶性总 HTT 蛋白（野生型和突变型，红色柱形），其水平与突变型 HTT 蛋白水平的细微差异高度相关。（图示：human-mouse-total-huntingtin-detection-kit，小鼠脑组织样本分析相关图示）

突变型和总 HTT 检测的 HTRF 与 Western Blot 对比分析

对 1 只野生型小鼠和 1 只症状前 zQ175 小鼠的多种脑组织（皮层、海马体、小脑），进行 HTRF 突变型 / 总 HTT 检测与 Western Blot 技术的平行对比。按照上一部分的方法制备组织裂解液，取含可溶性 HTT 蛋白的上清液分别进行 HTRF 检测和 Western Blot 检测。为确保检测物浓度处于各方法的线性范围内，检测前将裂解液用添加蛋白酶抑制剂的 1X 2 号裂解缓冲液预稀释（HTRF：突变型 HTT 检测稀释 1/8，总 HTT 检测稀释 1/4；Western Blot：两种检测均稀释 1/20）。结果显示：HTRF 突变型 / 总 HTT 检测与 Western Blot 的结果具有可比性。两种方法均未在野生型小鼠脑组织中检测到可溶性突变型 HTT，而在症状前 zQ175 小鼠的所有样本中均能准确定量该蛋白。如预期所示，所有裂解液中均检测到可溶性总 HTT 蛋白（野生型和突变型），其水平与三种不同脑组织的突变型 HTT 水平差异高度相关。（图示：human-mouse-total-huntingtin-detection-kit，HTRF 与 Western Blot 对比相关图示）

人源和鼠源神经母细胞瘤细胞系的总 HTT 检测验证

将人源 SH-SY5Y 和鼠源 Neuro-2a 神经母细胞瘤细胞系接种到 T175 培养瓶的完全培养基中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养 48 小时。加入 3 毫升 1X 2 号裂解缓冲液，室温温和振荡 30 分钟裂解细胞。细胞裂解液离心后，取上清液用 1X 2 号裂解缓冲液进行系列稀释，取 10 微升各稀释液转移至低体积白色微孔板，加入 10 微升 HTRF 总 HTT 检测试剂。结果显示：该 HTRF 总 HTT 检测适用于定量 SH-SY5Y 和 Neuro-2a 细胞裂解液中存在的可溶性野生型人源和鼠源 HTT 蛋白水平。（图示：human-mouse-total-huntingtin-detection-kit，神经母细胞瘤细胞系验证相关图示）

产品规格

其他规格

• 应用领域：Protein Quantification
• 自动化兼容性：Yes
• 品牌：HTRF
• 检测方式：HTRF
• 裂解缓冲液兼容性：Lysis Buffer 2、Lysis Buffer 3
• 分子修饰：Total
• 产品类别：Kit
• 样本体积：10 µL
• 运输条件：干冰运输
• 靶标类别：Biomarkers
• 靶标物种：人、小鼠
• 技术平台：TR-FRET
• 治疗领域：Neuroscience
• 单位规格：500 assay points