产品概述

腺相关病毒（AAV）载体是用于治疗多种人类疾病的主流基因递送平台。AAV5 血清型（AAV5）经证实具有最低的血清阳性率，且与预先存在的中和抗体交叉反应极低，这一特性使其作为甲型血友病及与其天然组织靶向性相关疾病（如肺部、视网膜或中枢神经系统疾病）的基因治疗载体具有显著优势。该 AAV5 试剂盒采用易操作的免洗涤格式，专门用于检测和定量 AAV5 颗粒。相较于酶联免疫吸附试验（ELISA），其操作简便、稳定性强，且检测通量更高。

工作原理

AAV5 衣壳检测原理

腺相关病毒 5 型（AAV5）检测可对细胞上清液或细胞裂解液中的 AAV5 衣壳进行定量。该检测采用两种抗 AAV5 抗体：一种标记有 d2（受体荧光团），另一种偶联生物素（生物素化抗体），可与预混液中的链霉亲和素 - 铕穴状化合物（供体荧光团）结合。当细胞提取物或上清液中存在 AAV5 衣壳时，加入上述偶联物会使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中衣壳浓度呈正相关，且在免洗涤检测格式下，可用于评估实验变量引起的任何变化。（附图标注：1assay-principle-aav5-64aav5peg-64aav5peh-64aav5pey.svg，对应 “AAV5 衣壳检测原理示意图”）

AAV5 衣壳检测流程

下述 AAV5 衣壳检测流程采用 384 孔小体积白色检测板。将 5μL 样品或标准品与 5μL 稀释液直接加入检测板中，随后使用均相时间分辨荧光（HTRF®）试剂进行检测。生物素化抗 AAV5 抗体需先与标记供体荧光团的链霉亲和素预混合，再加入检测体系。该检测可灵活适配至 1536 孔板格式，只需按比例调整各试剂的添加体积即可。（附图标注：2assay-protocol-aav5-64aav5peg-64aav5peh-64aav5pey.svg，对应 “AAV5 衣壳检测流程示意图”）

检测详情

AAV5 衣壳检测规格

• 样品体积：5μL
• 最终检测体积：20μL
• 结果获取时间：室温孵育过夜
• 稀释液中检测下限（LOD）：4.48×10⁸ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL）
• 动态范围：1.49×10⁹ – 2.50×10¹¹ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL）
• 样品兼容性：从原始收获物到终产品均可检测；兼容细胞上清液、细胞裂解液（适配裂解缓冲液 LB#3）

（附图标注：3assay-validation-aav5-64aav5peg-64aav5peh-64aav5pey-full-empty-recognition.svg，对应 “AAV5 衣壳检测规格表”）

分析性能

精密度（Precision）

批内精密度

对 3 个样品各重复检测 24 次，并计算每个样品的变异系数（% CV）。其中，样品 1 的 AAV5 平均浓度为 2.00×10¹¹ VP/mL，变异系数为 6%；样品 2 的 AAV5 平均浓度为 5.00×10¹⁰ VP/mL，变异系数为 2%；样品 3 的 AAV5 平均浓度为 1.25×10¹⁰ VP/mL，变异系数为 3%；3 个样品的平均变异系数为 4%。

批间精密度

3 个样品由不同操作者在 3 次独立实验中检测，并计算每个样品的变异系数（% CV）。其中，样品 1 的 AAV5 平均浓度为 2.00×10¹¹ VP/mL，变异系数为 7%；样品 2 的 AAV5 平均浓度为 3.20×10¹⁰ VP/mL，变异系数为 8%；样品 3 的 AAV5 平均浓度为 1.28×10¹⁰ VP/mL，变异系数为 11%；3 个样品的平均变异系数为 9%。

稀释线性（Dilutional Linearity）

对高浓度样品进行梯度稀释验证，原液的 AAV5 实测浓度为 2.33×10¹¹ VP/mL，回收率为 100%；2 倍稀释后，预期 AAV5 浓度为 9.31×10¹⁰ VP/mL，实测浓度为 8.89×10¹⁰ VP/mL，回收率为 105%；4 倍稀释后，预期 AAV5 浓度为 3.72×10¹⁰ VP/mL，实测浓度为 3.76×10¹⁰ VP/mL，回收率为 99%；8 倍稀释后，预期 AAV5 浓度为 1.49×10¹⁰ VP/mL，实测浓度为 1.56×10¹⁰ VP/mL，回收率为 96%；16 倍稀释后，预期 AAV5 浓度为 5.96×10⁹ VP/mL，实测浓度为 6.52×10⁹ VP/mL，回收率为 91%；所有稀释梯度的平均回收率为 98%。

干扰因素（Interferences）

SF9 细胞裂解液干扰

当 AAV5 浓度为 5.0×10¹⁰ VP/mL 时，SF9 细胞裂解液总蛋白浓度为 0.5 mg/mL 时回收率为 126%，0.25 mg/mL 时回收率为 120%，0.125 mg/mL 时回收率为 122%，0.05 mg/mL 时回收率为 115%。

HEK293 细胞裂解液干扰

当 AAV5 浓度为 5.0×10¹⁰ VP/mL 时，HEK293 细胞裂解液总蛋白浓度为 0.5 mg/mL 时回收率为 128%，0.25 mg/mL 时回收率为 115%，0.125 mg/mL 时回收率为 109%，0.05 mg/mL 时回收率为 115%。

抗原加标回收率（Antigen Spike and Recovery）

SF9 细胞裂解液（总蛋白浓度 0.05 mg/mL）

在总蛋白浓度为 0.05 mg/mL 的 SF9 细胞裂解液中加入不同浓度 AAV5 标准品：加入浓度为 2.05×10¹¹ VP/mL 的标准品时回收率为 110%，加入浓度为 5.12×10¹⁰ VP/mL 的标准品时回收率为 117%，加入浓度为 1.28×10¹⁰ VP/mL 的标准品时回收率为 112%，平均回收率为 113%。

HEK293 细胞裂解液（总蛋白浓度 0.25 mg/mL）

在总蛋白浓度为 0.25 mg/mL 的 HEK293 细胞裂解液中加入不同浓度 AAV5 标准品：加入浓度为 2.05×10¹¹ VP/mL 的标准品时回收率为 107%，加入浓度为 5.12×10¹⁰ VP/mL 的标准品时回收率为 115%，加入浓度为 1.28×10¹⁰ VP/mL 的标准品时回收率为 104%，平均回收率为 109%。

交叉反应性（Cross Reactivities）

对 AAV 家族其他血清型的交叉反应性检测结果显示：该试剂盒对 AAV5 的交叉反应性为 100%，对 AAV1、AAV2、AAV3B、AAV6、AAV8、AAV9 均无交叉反应。

检测验证

AAV5 完整颗粒与空颗粒的 HTRF 检测验证

为验证试剂盒对 AAV5 完整衣壳与空衣壳的检测能力，实验分析了其对 AAV5-CMV-eGFP 完整颗粒（含基因组）和 AAV5 空衣壳的识别效果。首先通过独立样品定量实验，将不同浓度的 AAV5-CMV-eGFP（以 GC/mL 为单位）转换为 VP/mL；随后将稀释后的完整颗粒或空衣壳各取 5μL 加入 384 孔小体积白色检测板，再加入 5μL 稀释液和 10μL HTRF AAV5 衣壳检测试剂，室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果显示，该 HTRF AAV5 衣壳检测试剂盒对 AAV5 完整颗粒与空颗粒的检测效果一致。（附图标注：4assay-validation-aav5-64aav5peg-64aav5peh-64aav5pey-full-empty-recognition.svg，对应 “AAV5 完整与空衣壳检测验证图”）

产品规格

• 应用领域：生物工艺（Bioprocessing）
• 品牌：HTRF
• 检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
• 裂解缓冲液兼容性：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 2、裂解缓冲液 3、裂解缓冲液 4
• 产品类别：试剂盒（Kit）
• 样品体积：5μL
• 运输条件：干冰运输（Shipped in Dry Ice）
• 靶标类别：病毒颗粒（Viral Particles）
• 技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
• 单位规格：10,000 次检测（10,000 assay points）