产品概述

腺相关病毒（AAV）载体是用于治疗多种人类疾病的主流基因递送平台。AAV8 血清型（AAV8）作为基因治疗载体时，其肝细胞转导效率高于其他血清型，这促使科研人员致力于将该病毒开发为血友病基因治疗载体。AAV8 对脑、肌肉、视网膜等其他组织也具有天然靶向性。该 AAV8 试剂盒采用易操作的免洗涤格式，专门用于检测和定量 AAV8 颗粒。相较于酶联免疫吸附试验（ELISA），该试剂盒操作简便、稳定性强，且检测通量更高。

工作原理

AAV8 衣壳检测原理

腺相关病毒 8 型（AAV8）检测可对细胞上清液或细胞裂解液中的 AAV8 衣壳进行定量。该检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。当细胞提取物或上清液中存在 AAV8 衣壳时，加入上述偶联物会使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中衣壳浓度呈正相关，且在免洗涤检测格式下，可用于评估实验变量引起的任何变化。（标注：assay principle AAV8，对应 “AAV8 衣壳检测原理”）

AAV8 衣壳检测流程

下述 AAV8 衣壳检测流程采用 384 孔小体积白色检测板。将 5 微升样品或标准品与 5 微升稀释液直接加入检测板中，随后使用均相时间分辨荧光（HTRF®）试剂进行检测。加入标记 HTRF 荧光团的抗体后，在室温下孵育过夜。该检测可灵活适配至 1536 孔板格式，只需按比例调整各试剂的添加体积即可。（标注：assay protocol AAV8，对应 “AAV8 衣壳检测流程”）

检测详情

AAV8 衣壳检测规格

（标注：assay specification AAV8，对应 “AAV8 衣壳检测规格”）

• 样品体积：5 微升
• 最终检测体积：20 微升
• 结果获取时间：室温（RT）孵育过夜
• 稀释液中检测限（LOD）：2.50×10⁸ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL）
• 动态范围：3.09×10⁹ – 2.50×10¹¹ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL）
• 样品兼容性：适用于从原始收获物到终产品的各类样品；兼容细胞上清液、细胞裂解液（适配裂解缓冲液 LB#3）

分析性能

精密度（Precision）

批内精密度

对 3 个样品各重复检测 24 次，并计算每个样品的变异系数（% CV）。其中，样品 1 的 AAV8 平均浓度为 1.60×10¹¹ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL），变异系数为 3%；样品 2 的 AAV8 平均浓度为 1.00×10¹⁰ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL），变异系数为 4%；样品 3 的 AAV8 平均浓度为 5.00×10¹⁰ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL），变异系数为 5%；3 个样品的平均变异系数为 4%。

批间精密度

所有样品均由不同操作者在 3 次独立实验中检测，并计算每个样品的变异系数（% CV）。其中，样品 1 的 AAV8 平均浓度为 2.00×10¹¹ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL），变异系数为 1%；样品 2 的 AAV8 平均浓度为 1.00×10¹¹ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL），变异系数为 7%；样品 3 的 AAV8 平均浓度为 5.00×10¹⁰ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL），变异系数为 8%；3 个样品的平均变异系数为 5%。

稀释线性（Dilutional Linearity）

实验获得的优异回收率表明，该检测具有良好的稀释线性。实验所用样品为 AAV8 空衣壳，使用试剂盒中的 DIL5 稀释液进行系列稀释。原液的 AAV8 实测浓度为 2.00×10¹¹ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL），回收率为 100%；2 倍稀释后，预期 AAV8 浓度为 1.05×10¹¹ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL），实测浓度为 1.03×10¹¹ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL），回收率为 98%；4 倍稀释后，预期 AAV8 浓度为 5.26×10¹⁰ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL），实测浓度为 4.82×10¹⁰ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL），回收率为 92%；8 倍稀释后，预期 AAV8 浓度为 2.63×10¹⁰ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL），实测浓度为 2.31×10¹⁰ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL），回收率为 88%；16 倍稀释后，预期 AAV8 浓度为 1.31×10¹⁰ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL），实测浓度为 1.21×10¹⁰ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL），回收率为 92%；所有稀释梯度的平均回收率为 94%。

干扰因素（Interferences）

实验选用 AAV 生产过程中具有代表性的两种细胞系（SF9 细胞和 HEK293 细胞），将其接种于 T175 培养瓶中，使用完全培养基在 37℃、5% 二氧化碳条件下培养。随后加入 3 毫升 1× 裂解缓冲液 #3，在室温下轻轻振荡 30 分钟，使细胞裂解。将浓度为 6.0×10¹⁰ 病毒颗粒 / 毫升（VP/mL）的 AAV8 衣壳，分别加入不同稀释度的未表达 AAV 衣壳的 SF9 细胞裂解液或 HEK293 细胞裂解液中（对应不同总蛋白浓度，单位：毫克 / 毫升）。检测所有样品（包括未添加衣壳的裂解液）的 AAV8 含量。结果显示，在 SF9 细胞或 HEK293 细胞的对照裂解液中未检测到 AAV8。但为准确量化 AAV8 浓度，需使用裂解缓冲液 #3 稀释裂解液，确保 SF9 细胞裂解液和 HEK293 细胞裂解液的总蛋白浓度均低于 1 毫克 / 毫升。当细胞裂解液总蛋白浓度过高时，会产生干扰，可能影响 AAV8 浓度检测的准确性。具体干扰数据如下：

• 对于 SF9 细胞裂解液（AAV8 浓度为 6.0×10¹⁰ 病毒颗粒 / 毫升）：总蛋白浓度为 1 毫克 / 毫升时回收率为 101%，0.5 毫克 / 毫升时为 107%，0.25 毫克 / 毫升时为 105%，0.125 毫克 / 毫升时为 160%，0.05 毫克 / 毫升时为 102%。
• 对于 HEK293 细胞裂解液（AAV8 浓度为 6.0×10¹⁰ 病毒颗粒 / 毫升）：总蛋白浓度为 1 毫克 / 毫升时回收率为 109%，0.5 毫克 / 毫升时为 107%，0.25 毫克 / 毫升时为 102%，0.125 毫克 / 毫升时为 107%，0.05 毫克 / 毫升时为 111%。

抗原加标回收率（Antigen Spike and Recovery）

将三种不同浓度的 AAV8 衣壳，分别与用裂解缓冲液 #3 稀释至 1 毫克 / 毫升的 SF9 细胞裂解液或 HEK293 细胞裂解液混合（独立操作）。将实测浓度与预期浓度进行比较，计算回收率（以百分比表示）。

• SF9 细胞裂解液（1 毫克 / 毫升）加标回收：加入浓度为 1.34×10¹⁰ 病毒颗粒 / 毫升的 AAV8 标准品时回收率为 116%，加入 2.93×10¹⁰ 病毒颗粒 / 毫升时为 108%，加入 5.41×10¹⁰ 病毒颗粒 / 毫升时为 115%，平均回收率为 113%。
• HEK293 细胞裂解液（1 毫克 / 毫升）加标回收：加入浓度为 1.34×10¹⁰ 病毒颗粒 / 毫升的 AAV8 标准品时回收率为 118%，加入 2.93×10¹⁰ 病毒颗粒 / 毫升时为 104%，加入 5.41×10¹⁰ 病毒颗粒 / 毫升时为 116%，平均回收率为 113%。

交叉反应性（Cross Reactivities）

对 AAV 家族其他血清型的交叉反应性进行了评估。使用试剂盒稀释液稀释各血清型 AAV 衣壳，为每种血清型绘制标准曲线。将 5 微升衣壳加入 384 孔小体积白色检测板，依次加入 5 微升稀释液和 10 微升 HTRF AAV8 衣壳检测试剂，在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。根据检测的标准曲线对信号进行插值计算，得出浓度值。结果显示，该检测对 AAV8 具有特异性，未检测到与其他血清型的交叉反应。具体交叉反应性数据如下：AAV8 为 100%，AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV9 均无交叉反应。

检测验证

AAV8 完整颗粒与空颗粒的 HTRF 检测验证

为验证该试剂盒对 AAV8 完整衣壳与空衣壳的检测能力，实验分析了其对 AAV8-CMV-eGFP 完整颗粒（含基因组）和 AAV8 空衣壳的识别效果。通过独立样品定量实验，将不同浓度的 AAV8-CMV-eGFP（单位：GC/mL）转换为病毒颗粒 / 毫升（VP/mL）。随后将稀释后的完整颗粒或空衣壳各取 5 微升加入 384 孔小体积白色检测板，再加入 5 微升稀释液和 10 微升 HTRF AAV8 衣壳检测试剂，在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果显示，该 HTRF AAV8 衣壳检测试剂盒对 AAV8 完整颗粒与空颗粒的检测效果一致。（标注：assay validation AAV8，对应 “AAV8 衣壳检测验证”）

产品规格

其他规格

• 应用领域（Application）：生物工艺（Bioprocessing）
• 品牌（Brand）：HTRF
• 检测方式（Detection Modality）：HTRF（均相时间分辨荧光）
• 裂解缓冲液兼容性（Lysis Buffer Compatibility）：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 2、裂解缓冲液 3、裂解缓冲液 4
• 产品类别（Product Group）：试剂盒（Kit）
• 样品体积（Sample Volume）：5 微升
• 运输条件（Shipping Conditions）：干冰运输（Shipped in Dry Ice）
• 靶标类别（Target Class）：病毒颗粒（Viral Particles）
• 技术平台（Technology）：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
• 单位规格（Unit Size）：10,000 次检测（10,000 assay points）