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HTRF ALPHA-SMA KIT - 10K PTS

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概述

组织损伤后，炎症细胞局部释放的转化生长因子 -β（TGF-β）会激活局部成纤维细胞或静息状态的肝星状细胞（HSCs，hepatic stellate cells）。这一过程会促使上述细胞分化为肌成纤维细胞，而肌成纤维细胞的功能是迁移至受损组织，并合成细胞外基质（ECM，extracellular matrix）成分以修复损伤。肌成纤维细胞的特征是从头表达 α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA），该蛋白会整合到肌动蛋白应力纤维中，使细胞具备高度收缩活性。慢性组织损伤会导致肌成纤维细胞（α-SMA 阳性）持续从头形成、过度收缩及细胞外基质过度沉积，最终引发组织纤维化。

作用机制

检测原理

α-SMA 检测基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET，Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer）夹心免疫检测格式，包含两种抗体：一种用铕离子 - 穴状化合物（Eu³⁺-Cryptate）标记（供体），另一种用 d2 荧光团标记（受体）。这两种抗体会特异性结合 α-SMA，当供体与受体因抗体 - 抗原结合而靠近时，会产生荧光 TR-FRET 信号。

检测方案

双板检测方案

为提升实验灵活性，本检测可采用双板检测方案：先在培养板中完成细胞接种、处理及裂解；进入检测阶段后，将细胞裂解液转移至 96 孔或 384 孔低体积检测微孔板中，再加入均相时间分辨荧光（HTRF，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence）试剂。该方案能够同时监测细胞活力与融合度。检测试剂可预先混合，通过单次加样步骤直接进行检测。本检测既适用于冷冻细胞裂解液，也适用于培养状态下的新鲜细胞。

检测验证

经 siRNA 实验验证对 α-SMA 亚型的特异性

将人肝星状细胞系 LX-2 * 与小鼠成纤维细胞系 NIH/3T3 接种到经培养处理的 96 孔板中（每孔 10,000 个细胞），在 37℃、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育 24 小时。次日，用 α-SMA 小干扰 RNA（siRNA）或阴性对照 siRNA 转染细胞 24 小时，随后用或不用 2.5 ng/mL 的转化生长因子 -β1（TGF-β1）继续处理细胞 24 小时。移除培养基后，用添加了补充剂的 3 号裂解缓冲液裂解细胞（LX-2 细胞每孔 50 μL，NIH/3T3 细胞每孔 200 μL），在室温（RT，Room Temperature）下轻轻振荡 30 分钟。取 16 μL 裂解液转移至低体积白色微孔板中，再加入 4 μL HTRF® α-SMA 检测抗体。结果显示，在两种细胞系中，与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，转染 α-SMA siRNA 的细胞其 HTRF 特异性信号显著降低（约 60%-70%），这表明 HTRF® α-SMA 检测对 α-SMA 亚型具有特异性，且不会与其他肌动蛋白亚型发生交叉反应。

* 注：LX-2 细胞系由 EMD Millipore 公司提供（产品编号 #SCC064）

肝星状细胞（HSCs）分化为肌成纤维细胞过程中的 α-SMA 表达

将人肝星状细胞系 LX-2 * 接种到经培养处理的 96 孔板中（每孔 50,000 个细胞），加入完全培养基，在 37℃、5% CO₂条件下孵育。次日，用浓度递增的 TGF-β1 处理细胞 48 小时。移除培养基后，用 50 μL 添加了补充剂的 3 号裂解缓冲液裂解细胞，取 16 μL 裂解液转移至低体积白色微孔板中，随后加入 4 μL HTRF® α-SMA 检测抗体。结果显示，TGF-β1 处理使 α-SMA 表达水平提高 2 倍，这一现象表明肝星状细胞已分化为肌成纤维细胞。

* 注：LX-2 细胞系由 EMD Millipore 公司提供（产品编号 #SCC064）

肺纤维化中原代人肺成纤维细胞（HLFs）向肌成纤维细胞的分化

将原代人肺成纤维细胞（HLFs，human lung fibroblasts）接种到经培养处理的 96 孔板中（每孔 20,000 个细胞），加入完全培养基，在 37℃、5% CO₂条件下过夜孵育。随后，将细胞在无血清培养基中继续孵育 24 小时，之后用浓度递增的 TGF-β1 处理细胞 48 小时。移除培养基后，用 50 μL 添加了补充剂的 3 号裂解缓冲液裂解细胞，在室温下轻轻振荡 30 分钟，取 16 μL 裂解液转移至低体积白色微孔板中，再加入 4 μL HTRF® α-SMA 检测抗体。结果显示，用 TGF-β1 长期处理细胞后，α-SMA 表达水平提高 4 倍，表明原代人肺成纤维细胞已分化为肌成纤维细胞。

成纤维细胞分化为肌成纤维细胞过程中的 α-SMA 表达

将小鼠成纤维细胞系 NIH/3T3 接种到经培养处理的 96 孔板中（每孔 6,250 个或 12,500 个细胞），加入完全培养基，在 37℃、5% CO₂条件下孵育。次日，在添加了 0.2% 牛血清白蛋白（BSA，bovine serum albumin）的无血清、无抗生素培养基中，用浓度递增的 TGF-β1 处理细胞 48 小时。移除培养基后，用 200 μL 添加了补充剂的 3 号裂解缓冲液裂解细胞，在室温下轻轻振荡 30 分钟，取 16 μL 裂解液转移至低体积白色微孔板中，随后加入 4 μL HTRF® α-SMA 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果显示，TGF-β1 长期处理使 α-SMA 表达水平提高 3 倍，证明成纤维细胞已分化为肌成纤维细胞。

HTRF α-SMA 检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的比较

将 NIH/3T3 细胞接种到 T175 培养瓶中，在 37℃条件下孵育 2 天。移除培养基后，在室温下轻轻振荡，裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。用添加了补充剂的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取各稀释度的 16 μL 裂解液转移至低体积白色微孔板中，随后加入 4 μL HTRF® α-SMA 检测试剂。取等量裂解液，通过蛋白质印迹法进行平行对比。结果显示，使用 HTRF® α-SMA 检测试剂时，仅需 200 个细胞即可检测到最低信号；而蛋白质印迹法需 800 个细胞才能检测到显著信号。因此，HTRF® α-SMA 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

简化通路

转化生长因子 -β（TGF-β）信号通路

TGF-β 是一种促纤维化细胞因子，是诱导肌成纤维细胞形成的主要因子。依赖 SMAD 蛋白的 TGF-β 信号通路会激活转录因子 SMAD2/3，进而启动 ACTA2 基因的转录，最终实现 α-SMA（α- 平滑肌肌动蛋白，α-Smooth Muscle Actin）的表达。这种特异性肌动蛋白亚型会整合到肌动蛋白应力纤维中，使细胞具备分化后肌成纤维细胞特有的强收缩活性。此外，TGF-β 还可通过非依赖 SMAD 蛋白的通路传递信号，具体机制为激活依赖 TAK1 的激酶（p38、JNK、NF-κB）以及 AKT、ERK 激酶。

规格参数

其他规格

类别	详情
应用领域（Application）	蛋白质定量（Protein Quantification）
品牌（Brand）	HTRF
检测方式（Detection Modality）	HTRF
产品类别（Product Group）	试剂盒（Kit）
样本体积（Sample Volume）	16 微升（16 µL）
运输条件（Shipping Conditions）	干冰运输（Shipped in Dry Ice）
靶标类别（Target Class）	生物标志物（Biomarkers）
靶标物种（Target Species）	人（Human）
技术（Technology）	时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域（Therapeutic Area）	心血管疾病（Cardiovascular）、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化（NASH/Fibrosis）
单位规格（Unit Size）	10,000 个检测点（10,000 assay points）

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货号：62ASMAPEH

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