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HTRF HU. AMYLOID B1-42 KIT - 500 PTS 人淀粉样蛋白β 1-42试剂盒，500 个检测点

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概述

β 淀粉样蛋白 1-40（Amyloid β1-40）和 β 淀粉样蛋白 1-42（β1-42）肽与阿尔茨海默病症状的出现相关。这两种淀粉样蛋白肽的产生受 β 分泌酶和 γ 分泌酶这两种酶的活性调控，这两种酶可切割淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein）。本试剂盒旨在检测细胞上清液或完整细胞中的 β 淀粉样蛋白 1-42 肽。凭借我们 “加样即读数”（Add and Read）方法的简便操作流程，该检测方法是酶联免疫吸附试验（ELISA）的一种快速替代方案。

检测原理与操作流程

人 β 淀粉样蛋白 1-42 检测原理

人 β 淀粉样蛋白 1-42 检测可测定细胞或组织上清液、细胞裂解液中的人 β 淀粉样蛋白 1-42 肽。该检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对人 β 淀粉样蛋白 1-42 肽上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在人 β 淀粉样蛋白 1-42 肽时，加入这些偶联抗体后，供体荧光团会与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中目标蛋白的浓度呈直接正相关，且在 “无需洗涤” 的检测模式下，可用于评估实验变量引起的蛋白浓度变化。

人 β 淀粉样蛋白 1-42 检测操作流程

人 β 淀粉样蛋白 1-42 检测试剂盒采用 “双板检测流程”：细胞在同一培养板中铺板、刺激，必要时可在该板中进行裂解。随后将细胞上清液和 / 或裂解液转移至检测板，以检测人 β 淀粉样蛋白 1-42。该流程可实时监测细胞活力与融合度。标记有均相时间分辨荧光（HTRF）荧光团的抗体可预先混合，通过单次加样步骤加入，进一步简化检测流程。通过按比例调整各试剂的加样体积，该检测可在 96 孔板或 384 孔板中进行。

检测详细信息

人 β 淀粉样蛋白 1-42 检测规格参数

项目	规格
样品量	16 微升（µL）
最终检测体积	20 微升（µL）
结果获取时间	室温（RT）下过夜
检测限	9 皮克 / 毫升（pg/mL）
动态范围	40-2000 皮克 / 毫升（pg/mL）
样品兼容性	细胞上清液、细胞裂解液（使用 1 号裂解液，LB#1）

分析性能

精密度

批内精密度（n=24）

样品编号	β 淀粉样蛋白 1-42 平均浓度（pg/mL）	变异系数（CV）
1	200	6%
2	800	4%
3	1500	3%

注：每个样品均检测 24 次，并计算各样品的变异系数（% CV）。

批间精密度（n=4）

样品编号	β 淀粉样蛋白 1-42 平均浓度（pg/mL）	变异系数（CV）
1	192	2.30%
2	341	1.90%
3	1109	0.50%

注：每个样品由 4 名不同操作人员在 4 次独立实验中分别检测，并计算各样品的变异系数（% CV）。

抗原加标回收率

样品编号	标准 β 淀粉样蛋白 1-42 浓度（pg/mL）	加入的内源性 β 淀粉样蛋白 1-42 浓度（pg/mL）	预期 β 淀粉样蛋白 1-42 浓度（pg/mL）	实测 β 淀粉样蛋白 1-42 浓度（pg/mL）	抗原回收率
1	850	1164	1007	1212	120%
2	850	2200	1525	1742	114%
3	850	4140	2495	2703	108%
4	400	1164	782	908	116%
5	400	2200	1300	1405	108%
6	400	4140	2270	2256	99%

注：向 3 种稀释度的 HEK293 APPsw 细胞上清液（内源性样品）中加入两种浓度的重组 β 淀粉样蛋白 1-42（400 pg/mL 和 850 pg/mL），通过比较预期浓度与实测浓度计算抗原回收率。

稀释线性

稀释倍数	预期浓度（pg/mL）	实测浓度（pg/mL）	回收率
未稀释	569.29	569.29	100%
2 倍	284.65	278.93	98%
4 倍	142.32	128.00	90%
8 倍	71.16	77.72	109%
16 倍	35.58	34.04	96%
32 倍	17.79	15.65	88%

注：稀释实验在常规微量离心管中进行，低吸附微量离心管未对稀释线性产生显著影响（数据未展示）。样品为秀丽隐杆线虫（C.elegans）细胞提取物，使用试剂盒稀释液 DIL5 稀释。实验所得回收率表明该检测方法具有良好的稀释线性。

交叉反应性与干扰

重组肽	反应性	干扰作用
β 淀粉样蛋白 1-42	100%	/
β 淀粉样蛋白 3-42	~40%	/
β 淀粉样蛋白 1-38	无	无
β 淀粉样蛋白 1-43	无	无
β 淀粉样蛋白 17-42	无	无
β 淀粉样蛋白 1-40	无	~20%
淀粉样前体蛋白 770（APP770）	无	无

注：交叉反应性通过在试剂盒稀释液中制备重组肽标准曲线（浓度范围 60-2000 pg/mL）测定；干扰作用通过以下方式检测：向 β 淀粉样蛋白 1-42 浓度为 350 pg/mL 的样品中，加入 6 种浓度递增的肽（125-4000 pg/mL），观察对检测结果的影响。

检测验证

过表达瑞典突变型 APP 的 SH-SY5Y 细胞分泌人 β 淀粉样蛋白 1-42 的检测

人 SH-SY5Y APPsw 细胞样品由法国尼斯 CNRS-UMR 7275 分子与药理学研究所的 Chami Mounia 博士制备。该神经母细胞瘤细胞（CRL-2266；购自美国典型培养物保藏中心）经标准流程（Oules 等人，2012 [1]）构建，可稳定表达携带瑞典双突变（K670N/M671L；APPswe）的淀粉样前体蛋白，细胞培养于添加 10% 胎牛血清、青霉素 / 链霉素及 400 μg 遗传霉素的 DMEM 培养基中。细胞上清液中添加蛋白酶抑制剂混合物，于 - 80°C 保存直至检测。为在检测线性范围内最大程度降低稀释偏差，对每个样品进行多种稀释度检测以确定最佳条件。按照 HTRF 试剂盒说明书步骤，取 16 μL 上清液，在人 β 淀粉样蛋白 1-40 和 1-42 HTRF 试剂盒中进行三重检测。结果显示，该稳定表达瑞典双突变的细胞系，其 β 淀粉样蛋白浓度极高（超过 10000 pg/mL）—— 已知该突变会导致淀粉样前体蛋白（APP）被大量切割生成淀粉样蛋白肽。

[1] Oules, B., D. Del Prete, B. Greco, X. Zhang, I. Lauritzen, J. Sevalle, S. Moreno, P. Paterlini-Brechot, M. Trebak, F. Checler, F. Benfenati & M. Chami (2012) Ryanodine receptor blockade reduces amyloid-beta load and memory impairments in Tg2576 mouse model of Alzheimer Disease. J Neurosci, 32, 11820-34.

过表达瑞典突变型 APP 的 HEK293 细胞分泌人 β 淀粉样蛋白 1-42 的检测

人 HEK293 APPsw 细胞以 660,000 个细胞 / 毫升（cells/mL）的密度接种于含 10% 胎牛血清（FCS）的 DMEM 培养基培养瓶中，培养 48 小时。为防止淀粉样蛋白肽降解，向细胞上清液中添加蛋白酶抑制剂混合物，随后于 - 80°C 保存直至检测。为在检测线性范围内最大程度降低稀释偏差，对每个样品进行多种稀释度检测以确定最佳条件。按照 HTRF 试剂盒说明书步骤，取 16 μL 上清液，在人 β 淀粉样蛋白 1-40 和 1-42 HTRF 试剂盒中进行三重检测。结果显示，该稳定表达瑞典突变的细胞系分泌的 β 淀粉样蛋白浓度较高 —— 已知该突变会导致淀粉样前体蛋白（APP）被大量切割生成淀粉样蛋白肽。

简化通路

神经元细胞中淀粉样蛋白肽的分泌

β 淀粉样蛋白 1-40（Amyloid ß1-40）和 β 淀粉样蛋白 1-42（ß1-42）肽与阿尔茨海默病症状的出现相关。这两种淀粉样蛋白肽的产生受 β 分泌酶和 γ 分泌酶的活性调控，这两种酶可切割淀粉样前体蛋白（APP）。

正常生理状态：淀粉样前体蛋白（APP）通过 “非淀粉样蛋白生成途径” 加工 ——α 分泌酶切割 APP 生成可溶性淀粉样前体蛋白（soluble APP），该蛋白参与正常神经元功能的维持。
病理状态：APP 发生异常切割 —— 先由 β 分泌酶切割，再经 γ 分泌酶切割，释放出易聚集的淀粉样蛋白肽。这种 “淀粉样蛋白生成途径” 可导致淀粉样蛋白斑块形成，损害神经元功能，并可能引发神经退行性病变。

在阿尔茨海默病细胞模型中，检测分泌型 β 淀粉样蛋白肽的含量，对于评估淀粉样蛋白生成途径的活性至关重要。

（缩写说明：CTFa/b：α/β 羧基端片段；APP：淀粉样前体蛋白；ICD：APP 胞内结构域；P3：P3 蛋白，即 β 淀粉样蛋白 17-42，属于非淀粉样蛋白生成途径产物）

产品规格

其他规格参数

项目	规格
应用领域	蛋白定量
品牌	HTRF
检测方式	HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解液兼容性	1 号裂解液（Lysis Buffer 1）
产品类别	试剂盒（Kit）
样品体积	16 微升（µL）
运输条件	干冰运输
目标类别	生物标志物（Biomarkers）
目标物种	人（Human）
技术原理	TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
产品规格	500 次检测（assay points）

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货号：62B42PEG

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