皮质醇(Cortisol),又称氢化可的松(Hydrocortisone),是由肾上腺皮质产生并分泌的主要糖皮质激素。它参与调节葡萄糖代谢、脂肪分解、血压水平及应激抑制过程。皮质醇还可扩散进入细胞内,其在细胞内的水平受 11β- 羟类固醇脱氢酶(1 型或 2 型,11ß-hydroxysteroid dehydrogenase, type 1 or 2)的严格调控。皮质醇检测试剂盒能够快速、准确地测定皮质醇含量,即便对于肝脏微粒体、完整细胞、动物血清等复杂样本也适用。该试剂盒还可用于评估 11β- 羟类固醇脱氢酶 1 型(11ß-HSD1)的活性(包括内源性、重组型或微粒体型活性)。
本试剂盒基于竞争法检测原理,涉及两种关键试剂:一种是用穴状化合物(Cryptate,荧光供体)标记的特异性抗体,另一种是与 d2 分子(荧光受体)偶联的皮质醇。细胞产生的皮质醇会与 d2 标记的皮质醇竞争结合抗皮质醇铕(Eu)穴状化合物单克隆抗体。
(标注:biomarkers-how-it-works-assay-principle-cortisol-62crtpeg-62crtpeh,为图表 / 文件标识,保留原文)
皮质醇检测试剂盒采用简化的检测流程,仅需两步孵育操作:
- 目标化合物对细胞的刺激;
- 使用均相时间分辨荧光(HTRF)试剂进行皮质醇检测。
该流程在细胞刺激后,仅需单次孵育 2 小时即可完成检测。
(标注:biomarkers-how-it-works-assay-protocol-cortisol-62crtpeg-62crtpeh,为图表 / 文件标识,保留原文)
(标注:specifications-cortisol-1,为图表 / 文件标识,保留原文)
本皮质醇试剂盒可准确测定复杂样本(如血清、细胞、微粒体制备物)中的氢化可的松含量。图 2 汇总了在低体积 384 孔板中,使用均相时间分辨荧光(HTRF)皮质醇试剂进行微粒体 11β- 羟类固醇脱氢酶 1 型(11ß-HSD1)检测的结果。已知的 11β- 羟类固醇脱氢酶 1 型抑制剂 —— 甘珀酸(Carbenoxolone)和甘草次酸(Glycyrrhetinic acid)可抑制可的松向皮质醇的转化,其半数抑制浓度(IC50)分别为 0.33 微摩尔 / 升(µM)和 0.31 微摩尔 / 升(µM)。
具体实验操作:在 384 孔低体积板中,用还原型辅酶 Ⅱ(NADPH,浓度为 200 微摩尔 / 升)和可的松(浓度为 160 纳摩尔 / 升)刺激微粒体 11β- 羟类固醇脱氢酶 1 型(浓度为 0.2 毫克 / 毫升),同时加入不同浓度的甘草次酸和甘珀酸抑制剂。
实验同时绘制了已知皮质醇浓度的标准曲线。将培养板在 37°C 条件下孵育 2 小时后,加入皮质醇 - d2 偶联物和铕离子(Eu³⁺)穴状化合物标记的抗皮质醇抗体。
加入试剂后,将培养板在室温(RT)下孵育 4 小时,随后在 620 纳米(nm)和 665 纳米(nm)波长下读取荧光发射值。
(标注:assay-validation-cortisol-1,为图表 / 文件标识,保留原文)