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HTRF HMGB1 KIT - 10K PTS

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品牌： Revvity

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概述

在细胞核内，高迁移率族蛋白 B1（HMGB1）可与 DNA 及组蛋白相互作用，从而决定染色质结构。一旦被释放到细胞外，HMGB1 会获得新的角色 —— 作为 “警报素” 或 “损伤相关分子模式（DAMP）”，通过结合 Toll 样受体 4（TLR4）并促进细胞因子生成，启动炎症状态。

坏死、焦亡和凋亡均为受调控的细胞死亡机制，研究表明这些机制会导致不同形式的 HMGB1 释放。在焦亡过程中，HMGB1 会与白细胞介素 - 1β（IL-1β）和白细胞介素 - 18（IL-18）一同释放。

HMGB1 与多种自身免疫性疾病的病理过程相关，包括类风湿关节炎（RA）和系统性红斑狼疮（SLE）。

工作原理

检测原理

HMGB1 的检测采用双抗夹心免疫分析法，该方法使用两种特异性抗 HMGB1 抗体，两种抗体分别标记有 HTRF 供体荧光染料和受体荧光染料。检测信号的强度与样本中 HMGB1 的浓度呈直接正相关。

（标注：1biomarkers-how-it-works-assay-principle-hmgb1-62hmgpeg-62hmgpeh.svg，即 “HMGB1 检测原理示意图”）

检测流程

检测方案需使用 384 孔小体积白色板或瑞孚迪（Revvity）96 孔小体积板（最终反应体积为 20 微升），具体操作如下：将 16 微升细胞上清液、样本或标准品直接加入检测板中，随后用 HTRF® 试剂进行检测。标记有 HTRF 供体荧光团和受体荧光团的抗体可预先混合，通过单次加样步骤加入，进一步简化检测流程。该检测可在 96 孔板至 384 孔板中进行，只需按比例调整各试剂的添加体积即可。

（标注：2biomarkers-how-it-works-assay-protocol-hmgb1-62hmgpeg-62hmgpeh.svg，即 “HMGB1 检测流程示意图”）

检测详情

产品规格

样本量：16 微升
最终检测体积：20 微升
出结果时间：室温条件下 2 小时至过夜
试剂盒组成：冷冻标准品、冷冻检测抗体、缓冲液及实验方案
检测限（LOD）与定量限（LOQ）（稀释液中）：0.2 纳克 / 毫升、0.5 纳克 / 毫升
检测范围：0.78–50 纳克 / 毫升
适用物种：人、小鼠、大鼠
特异性：与牛源 HMGB1 无交叉反应

分析性能

精密度

板内精密度（n=24）

对 3 个样本分别进行 24 次检测，并计算每个样本的变异系数（CV）：样本 1 的 HMGB1 平均值为 2.4 纳克 / 毫升，变异系数 3.90%；样本 2 的 HMGB1 平均值为 6.6 纳克 / 毫升，变异系数 4.30%；样本 3 的 HMGB1 平均值为 18.9 纳克 / 毫升，变异系数 2.80%；3 个样本的平均变异系数为 4.10%。

（注：每个样本均检测 24 次，并计算每个样本的变异系数）

板间精密度（n=4）

对 3 个样本分别在 4 次独立实验中检测，并计算每个样本的变异系数（CV）：样本 1 的 HMGB1 平均值为 1.56 纳克 / 毫升，差值比平均值（delta ratio）为 298，变异系数 11%；样本 2 的 HMGB1 平均值为 6.25 纳克 / 毫升，差值比平均值为 1468，变异系数 13%；样本 3 的 HMGB1 平均值为 25 纳克 / 毫升，差值比平均值为 7150，变异系数 13%；3 个样本的平均变异系数为 12.3%。

（注：每个样本均在 4 次独立实验中检测，并计算每个样本的变异系数；delta ratio 为 HTRF 检测中的信号差值比指标）

加标回收率

取细胞上清液进行加标回收实验：当上清液中原有 HMGB1 为 4.1 纳克 / 毫升、加标量为 10.9 纳克 / 毫升时，理论值为 15.0 纳克 / 毫升，实测值为 13.4 纳克 / 毫升，回收率 89%；当上清液中原有 HMGB1 为 8.2 纳克 / 毫升、加标量为 10.9 纳克 / 毫升时，理论值为 19.1 纳克 / 毫升，实测值为 16.1 纳克 / 毫升，回收率 84%；当上清液中原有 HMGB1 为 14.4 纳克 / 毫升、加标量为 10.9 纳克 / 毫升时，理论值为 25.3 纳克 / 毫升，实测值为 21.3 纳克 / 毫升，回收率 84%。

检测验证

HMGB1 标准曲线验证

按照试剂盒说明书中的流程，将试剂盒提供的重组 HMGB1 标准品用 5 号稀释液进行系列稀释，以检测得到的 HTRF 信号（用差值比表示）为纵坐标、HMGB1 浓度为横坐标绘制标准曲线，完成标准曲线验证。

（标注：3assay-validation-hmgb1-1.svg，即 “HMGB1 标准曲线验证图”）

坏死性凋亡诱导的 THP-1 细胞中 HMGB1 的检测

为诱导 THP-1 细胞发生坏死性凋亡，将 THP-1 悬浮细胞以每孔 40 万个细胞的密度接种到 96 孔培养板中，每孔加入 200 微升含 10% 胎牛血清（FCS）、2 毫摩尔 / 升 L - 谷氨酰胺和 25 毫摩尔 / 升 HEPES 的 RPMI 1640 培养基。在部分选定孔中，加入 Z-VAD-FMK（终浓度 25 微摩尔 / 升）处理 1 小时以抑制胱天蛋白酶活性。低速离心后，小心吸弃培养基并更换新鲜培养基。胱天蛋白酶抑制处理后，加入肿瘤坏死因子 α（TNFα，终浓度 100 纳克 / 毫升）单独处理，或与 cIAP 抑制剂 BV-6（终浓度 5 微摩尔 / 升）联合处理，以诱导细胞坏死性凋亡。过夜孵育后，收集细胞上清液，按照试剂盒说明书的操作步骤检测其中 HMGB1 的含量，结果以 HMGB1 浓度表示。

（标注：4assay-validation-hmgb1-2.svg，即 “坏死性凋亡 THP-1 细胞中 HMGB1 检测结果图”）

焦亡诱导的 THP-1 细胞中 HMGB1 的检测

为诱导 THP-1 细胞发生焦亡，将 THP-1 悬浮细胞以每孔 20 万个或 40 万个细胞的密度接种到 96 孔培养板中，每孔加入 200 微升含 10% 胎牛血清（FCS）、2 毫摩尔 / 升 L - 谷氨酰胺和 25 毫摩尔 / 升 HEPES 的 RPMI 1640 培养基。用终浓度为 1 微克 / 毫升的脂多糖（LPS）对细胞进行 “预激活” 处理，3 小时预激活后进行低速离心，小心吸弃培养基并更换新鲜培养基。在部分选定孔中，加入终浓度为 8 微摩尔 / 升的尼日利亚菌素（Nigericin）以诱导细胞焦亡。过夜孵育后，收集细胞上清液，按照试剂盒说明书的操作步骤检测其中 HMGB1 的含量，结果以 HMGB1 浓度表示。

（标注：5assay-validation-hmgb1-3.svg，即 “焦亡 THP-1 细胞中 HMGB1 检测结果图”）

简化信号通路

焦亡与坏死性凋亡中的 HMGB1 信号通路

在焦亡过程中，HMGB1 的分泌由 NLRP3 炎症小体介导：第一个信号称为 “预激活”，通常由脂多糖（LPS）等微生物分子触发，该信号通过 NF-κB 通路诱导 NLRP3 和前体 IL-1β（pro-IL-1β）的表达；第二个信号称为 “激活”，由危险分子（如细胞外 ATP）或抗生素（如尼日利亚菌素）提供，该信号会激活炎症小体，随后引发胱天蛋白酶激活，最终导致 HMGB1 与 IL-18、IL-1β 一同分泌。

在坏死性凋亡过程中（坏死性凋亡是一种由受体相互作用蛋白激酶 1/3（RIPK1、RIPK3）、混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）及胱天蛋白酶 8 调控的坏死样细胞死亡形式），HMGB1 会被释放，但 IL-18 和 IL-1β 不会释放。具体机制为：肿瘤坏死因子 α（TNFα）与细胞表面受体结合后，会招募 TNF 受体相关死亡蛋白（TRADD），并通过 TNF 受体相关因子 2/3（TRAF2/3）向 RIPK1 传递信号；RIPK1 随后招募 RIPK3，形成 “坏死小体” 复合物，进而引发细胞坏死性凋亡。

（标注：6biomarkers-tab4-hmgb1-simplified-pathway-62hmgpeg-62hmgpeh-62hmgpej.svg，即 “焦亡与坏死性凋亡中 HMGB1 信号通路简化图”）

规格参数

应用领域：蛋白质定量
品牌：HTRF（均相时间分辨荧光技术）
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升
运输条件：干冰运输
靶点类别：生物标志物
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域：炎症、代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化、肿瘤学与炎症
单位规格：10000 个检测点

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货号：62HMGPEH

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