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HTRF GAPDH HOUSEKEEPING KIT - 500 PTS 磷酸甘油醛脱氢酶管家基因检测试剂盒 –500测试

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品牌： Revvity

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概述

本检测旨在测定细胞和组织中 GAPDH 的内源性表达水平，以便对所关注的磷酸化蛋白和 / 或总蛋白的实验数据进行标准化处理。甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（GAPDH）是一种关键的糖酵解酶，在所有细胞和组织中均持续且稳定地表达。其氨基酸序列在哺乳动物物种间具有高度同源性。这些特性使其成为最常用的管家蛋白之一。GAPDH 的浓度与细胞数量和总蛋白浓度成正比，因此被用作数据标准化的内参，以校正由实验变异性（如处理后培养板中剩余的细胞数量或裂解效率）引起的信号变化。仅需 4 µL 的低样本体积，且与所有 HTRF 磷酸化 - 总蛋白裂解缓冲液兼容，使得从同一份裂解物中可进行多参数分析，同时检测 GAPDH 与所关注的磷酸化蛋白和 / 或总蛋白。

工作原理

GAPDH 管家蛋白检测原理

GAPDH 管家蛋白检测用于测定细胞或组织裂解物中的内源性 GAPDH。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。GAPDH 管家蛋白检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的不同表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 GAPDH 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中 GAPDH 的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估由实验变异性引起的任何变化。

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GAPDH 管家蛋白双板检测方案

本检测采用双板检测方案，即在培养板中接种细胞并进行处理。在检测步骤中，将 4 µL 裂解物转移至小体积 96 孔或 384 孔白色板中，加入 12 µL 试剂盒稀释液，然后加入 4 µL HTRF® 试剂。该方案能够在合适的细胞培养板中监测细胞的活力和汇合度。

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检测验证

不同物种的不同细胞模型验证

将贴壁细胞系 HeLa（人）、NIH-3T3（小鼠）、GH1（大鼠）和 CHO-K1（仓鼠）以不同细胞密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。移除培养基后，用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 裂解细胞。将悬浮的人 Jurkat 细胞系以不同细胞密度分装 30 µL 到 96 孔半面积板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 1 小时，然后直接用 10 µL 补充的 4X 裂解缓冲液 #1 裂解。为通过 HTRF 检测 GAPDH 水平，将 4 µL 细胞裂解物（未稀释或在补充的裂解缓冲液中预稀释）转移至小体积白色微孔板中，补充 12 µL 稀释液 #11，然后加入 4 µL 预混合的检测抗体。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

HTRF GAPDH 管家蛋白试剂盒适用于不同物种的贴壁细胞和悬浮细胞。已在人、小鼠、大鼠和仓鼠来源的样品上验证，且与猴类物种兼容。检测范围和灵敏度已在最常用的细胞系和细胞密度上进行了优化。对于某些高表达 GAPDH 的细胞模型，裂解物在转移到检测板前必须在补充的 1X 裂解缓冲液中预稀释（例如，NIH-3T3 和 CHO-K1 裂解物需 1:4 预稀释；Jurkat 细胞裂解物需 1:5 预稀释）。

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与 HTRF 磷酸化 - 总蛋白裂解缓冲液的兼容性

将 GH1 细胞以不同细胞密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时，然后用 HTRF 磷酸化 - 总蛋白裂解缓冲液 #1、#2、#3 或 #4（补充有封闭试剂）裂解。为通过 HTRF 检测 GAPDH 水平，将 4 µL 细胞裂解物转移至小体积白色微孔板中，补充 12 µL 稀释液 #11，然后加入 4 µL 预混合的检测抗体。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

本检测与所有磷酸化 - 总蛋白裂解缓冲液兼容。使用裂解缓冲液 #1 时性能最佳。然而，其他三种裂解缓冲液即使在最低细胞密度下也能提供良好的检测窗口（信噪比 > 8）。这些结果表明，GAPDH 管家蛋白检测可在用于磷酸化蛋白和总蛋白检测的同一份裂解物上进行。有关更多信息，请参考裂解缓冲液兼容性表。

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在磷酸化蛋白和总蛋白检测中同步监测 GAPDH 水平

MEK 抑制剂 PD98059 对 HeLa 细胞中 ERK 抑制作用的研究

将 HeLa 细胞接种到 96 孔培养板中（100,000 个细胞 / 孔），孵育 24 小时后，用浓度递增的 MEK 抑制剂 PD98059 处理 30 分钟。用 50 µL 补充的裂解缓冲液 #1 裂解细胞后，将同一份裂解物依次分装到小体积白色检测板中：两次各 16 µL，用于通过 HTRF Advanced 磷酸化 ERK 和总 ERK 试剂盒（64AERPET/G/H 和 64NRKPET/G/H）联合分析磷酸化 ERK 和总 ERK 水平；另外 4 µL（补充 12 µL 稀释液 #11）用于通过 HTRF GAPDH 管家蛋白试剂盒监测 GAPDH 水平。加入 4 µL 相应的试剂盒检测试剂，在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

随着 PD98059 剂量的增加，ERK 磷酸化的抑制作用增强。由于 ERK 磷酸化的抑制并未导致总 ERK 或 GAPDH 水平的降低，因此可以排除毒性作为可能的作用机制。由此可以确定，PD98059 主要通过靶向 ERK 的上游激酶 MEK 来降低 ERK 的磷酸化水平。

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IGF-1 对 HEK293 细胞中 AKT 激活作用的研究

将 HEK293 细胞接种到 96 孔培养板中（100,000 个细胞 / 孔），孵育 24 小时后，用浓度递增的人 IGF-1 处理 10 分钟。用 50 µL 补充的裂解缓冲液 #1 裂解细胞后，将同一份裂解物依次分装到小体积白色检测板中：两次各 16 µL，用于通过 HTRF 磷酸化 AKT（Ser473）和总 AKT 试剂盒（64AKSPET/G/H 和 64NKTPET/G/H）联合分析磷酸化 AKT 和总 AKT 水平；另外 4 µL（补充 12 µL 稀释液 #11）用于通过 HTRF GAPDH 管家蛋白试剂盒监测 GAPDH 水平。加入 4 µL 相应的试剂盒检测试剂，在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

IGF-1 刺激细胞会诱导 AKT 在 Ser473 位点的磷酸化增加，并使 AKT 表达水平下调，两者均呈剂量依赖性，且具有相似的半数有效浓度（EC50）和半数抑制浓度（IC50）值。另一方面，GAPDH 水平保持不变，这表明总 AKT 的减少并非由整体蛋白质合成受抑制或实验问题引起。这个例子清楚地说明，需要对所关注的磷酸化蛋白、总蛋白以及 GAPDH 进行分析，才能正确理解化合物对该蛋白的作用。

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与 BCA 蛋白检测的相关性

按照第一部分所述方法制备接种在 96 孔板中不同细胞密度的 Jurkat、CHO-K1、HeLa 和 NIH-3T3 细胞系的裂解物。使用 HTRF 检测测定这些样品中管家蛋白 GAPDH 的水平。同时，按照制造商的说明，使用 BCA 蛋白检测（QuantiPro™ BCA 检测试剂盒，Sigma-Aldrich）从同一份裂解物中测定蛋白质浓度。对于这两种方法，裂解物均未经稀释或在适当的缓冲液中预稀释后进行分析，以确保所有样品均在各自检测的线性范围内进行测试。每张图表均表示 HTRF GAPDH 的信噪比（S/N）与通过 BCA 测定的蛋白质浓度之间的关系。各点旁标注了用于相关性分析的细胞密度。

在人、小鼠或仓鼠细胞系中，通过 HTRF 测定的 GAPDH 水平始终与通过 BCA 方法测定的蛋白质浓度具有良好的相关性（相关系数 r > 0.97）。这些结果表明，GAPDH 是一种合适的管家蛋白，可用于检查化合物对所关注蛋白的作用。

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组织样品验证

用补充的裂解缓冲液 #3 匀浆来自三只不同小鼠的肝组织样品，用补充的裂解缓冲液 #4 裂解一份大鼠肝组织样品。按照技术说明制备并分析样品。使用 HTRF 检测测定这些样品中管家蛋白 GAPDH 的水平。同时，按照制造商的说明，使用 BCA 蛋白检测（QuantiPro™ BCA 检测试剂盒，Sigma-Aldrich）从同一份裂解物中测定蛋白质浓度。对于这两种方法，裂解物均在适当的缓冲液中预稀释后进行分析（稀释倍数为 1:50 至 1:200），以确保所有样品均在各自检测的线性范围内进行测试。

GAPDH 管家蛋白检测与不同物种的组织裂解物兼容。该检测的灵敏度能够在蛋白质浓度低于 0.1 mg/mL 的样品中轻松检测到 GAPDH。通过 HTRF 测定的 GAPDH 水平始终与通过 BCA 方法测定的蛋白质浓度具有良好的相关性。这些结果表明，GAPDH 是一种合适的管家蛋白，可用于标准化组织样品，以研究化合物在动物模型中的作用。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64GAPDHPEG

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