HTRF METHYLTRANSFERASE KIT - 50K PTS

概述

EPIgeneous甲基转移酶检测试剂盒是适用于所有甲基转移酶及底物（肽段、核小体、完整组蛋白、DNA、RNA、p53和小分子）的通用解决方案。该检测通过测量甲基转移酶将S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转化为S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）的过程来实现检测。该检测与大多数对SAM的Km值在0.4 µM至200 µM之间的酶兼容，为放射性检测提供了一种独特且稳定的替代方法。工作原理

酶促反应步骤原理 EPIgeneous甲基转移酶检测试剂盒是一种通用的生化检测方法，适用于所有组蛋白甲基转移酶（HMTs）和DNA甲基转移酶（DNMTs）家族中产生S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）的酶。通过测量S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）向SAH的转化来评估甲基转移酶的活性。 检测步骤原理 为直接测量SAH的释放，使用了标记有铽穴状化合物（Tb cryptate）的抗SAH抗体和SAH-d2示踪剂。酶促反应释放的SAH与SAH-d2示踪剂竞争结合抗体，导致HTRF信号降低。检测方案

在含有化合物的体系中孵育底物与酶，加入SAM（甲基供体）启动酶促反应，使底物发生甲基化。标记有铽穴状化合物的抗SAH特异性抗体与天然SAH和d2偶联的SAH竞争结合，产生的时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）信号与校准品或样品中SAH的浓度成反比。检测验证

DOT1L酶滴定 将人重组DOT1L在酶缓冲液中进行系列稀释，浓度范围为320 nM至0.001 nM。以10 ng/µl（即77 nM）的寡核小体为底物，2 µM SAM，在30°C下进行2小时检测。阴性对照（无SAM或无核小体）证实了对酶特异性活性的测量。选择4.5 nM的DOT1L浓度（EC80）用于后续实验，该浓度可使10%的SAM转化为SAH。 SGC0946对DOT1L检测的抑制作用 使用0.5 µM SAM（EC40）、77 nM寡核小体（EC80）和4.5 nM DOT1L（EC80）进行EPIgeneous甲基转移酶检测。30°C孵育2小时后，加入检测试剂终止酶促反应。SGC0946的半数抑制浓度（IC50）与文献（Yu等人，《自然通讯》，2012年）一致。正如预期，G9a选择性抑制剂BIX01294不会抑制DOT1L。不含酶的抑制剂对照表明，抑制剂不影响检测试剂。 检测灵敏度 该图表显示了在不同SAM浓度范围和不同SAM向SAH转化率下获得的检测窗口。使用试剂盒的校准曲线在检测稀释液中进行检测。EPIgeneous甲基转移酶检测已优化，适用于酶促反应步骤中较宽范围的SAM浓度（0.4–200 µM）。在这些SAM浓度下，该检测能够评估酶的活性，酶的转化率为4%至10%（即SAM向SAH的转化率为4%至10%）。规格

其他规格 - 应用：生化酶检测 - 品牌：EPIgeneous - 检测方式：HTRF - 产品类别：试剂盒 - 样本体积：120 µL - 运输条件：干冰运输 - 靶标类别：表观遗传学 - 技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET） - 治疗领域：代谢/糖尿病、神经科学、肿瘤学与炎症 - 单位规格：1,000次检测