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HTRF NFKB TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

总 NFkB 试剂盒可作为我们磷酸化 NFkB 试剂盒的标准化检测工具。NFkB（核因子 κB）在癌症研究中备受关注，并且是炎症反应中的关键参与者。HTRF 磷酸化和总 NFkB 检测试剂盒的缓冲液具有兼容性，能够从一份裂解物样本中同时分析磷酸化蛋白和总蛋白的含量。

工作原理
总 NFkB 检测原理
总 NFkB 检测可定量细胞裂解物中 NFkB 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 NFkB 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 NFkB 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET（荧光共振能量转移）信号。该信号强度与样本中蛋白质的浓度直接成正比，并且可在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的表达。

总 NFkB 双板检测方案
双板方案包括：在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后再加入总 NFkB HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 NFkB 单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测总 NFkB 可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证
在多种人 / 小鼠细胞中检测总 NFkB
将人源和鼠源细胞在去除血清的细胞培养基中接种到 96 孔板中，每孔 40,000 个细胞，并在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。通过用 10 nM 肿瘤坏死因子 α（TNFalpha）或 2 nM 白细胞介素 1β（IL1beta）刺激 10 分钟来诱导磷酸化状态。刺激后，移除培养基，用 50 µL 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移到 384 孔白色小体积微孔板中，并加入 4 µL HTRF 总 NFkB 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

使用总 NFkB 检测的 HTRF 检测与蛋白质印迹法（WB）对比
培养人 HeLa 细胞 48 小时后，用肿瘤坏死因子 α（TNFalpha）刺激。裂解后，离心收集可溶性组分。通过蛋白质印迹法和 HTRF 法对细胞裂解物的系列稀释液进行平行分析。结果表明，HTRF 总 NFkB 细胞检测比蛋白质印迹法更灵敏，因为使用 HTRF 总 NFkB 检测时，仅需 1000 个细胞即可检测到最小信号，而蛋白质印迹法则需要 4000 个细胞才能产生信号。

使用磷酸化和总 NFkB 试剂盒检测肿瘤坏死因子 α（TNFa）对 HeLa 细胞的剂量反应
接种 HeLa 细胞并培养 24 小时，然后暴露于不同浓度的肿瘤坏死因子 α（TNFalpha）中。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔白色小体积微孔板中，并加入 4 µL 磷酸化 NFkB（Ser536）或总 NFkB 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。随着肿瘤坏死因子 α（TNFa）浓度的增加，NFkB 的磷酸化水平升高，而蛋白质的总量（未磷酸化和磷酸化的总和）保持稳定。

BAY 11-7085 对磷酸化和总 NFkB 的药理学反应
长时间暴露于 BAY 11-7085 会导致 NFkB 表达水平下调，HTRF 总 NFkB 信号的降低证明了这一点。随着 BAY 浓度的增加，NFkB 的磷酸化水平也会下降。因此，根据磷酸化和总 NFkB 水平计算的标准化信号保持稳定。将 40,000 个 U937 细胞系细胞用不同浓度的 BAY 11-7085 处理 3 小时，同时用 10 nM 肿瘤坏死因子 α（TNFalpha）共刺激 10 分钟。裂解细胞后，将其转移到 384 孔白色小体积微孔板中，以检测 HTRF 磷酸化和总 NFkB。

简化通路
NFkB 通路的调节
NFkB 属于一个超家族，包含 5 个成员，由两个亚基组成（同源二聚体或异源二聚体），参与免疫反应的调节。存在两种主要的 NFkB 通路。经典通路涉及 p65 和 p50，由细胞因子或 Toll 样受体（TLR）激活触发。替代通路主要在淋巴细胞生成过程中被激活。 inactive 的 NFkB 二聚体被隔离在细胞质中。受到刺激后，IB 蛋白被磷酸化、泛素化并降解，从而激活 NF-B 复合物，使其转运到细胞核中。激活的 NFkB 有助于介导基因表达、炎症反应、细胞存活和细胞增殖。已发现 NFkB 通路的失调与多种自身免疫性疾病以及某些类型的癌症相关。

规格

其他规格
应用
细胞信号传导
品牌
HTRF
检测方式
HTRF
分子修饰
总（蛋白）
产品类别
试剂盒
样本体积
16 µL
运输条件
干冰运输
靶标类别
磷蛋白
靶标物种
人
小鼠
技术
时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域
非酒精性脂肪性肝炎 / 肝纤维化（NASH/Fibrosis）
神经科学
肿瘤学与炎症
单位规格
50,000 个检测点

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货号：64NFTPEY

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