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HTRF VEGFR2 P-Y1175 KIT - 10K PTS 磷酸化VEGFR(Y1175)检测试剂盒

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概述

用于监测磷酸化 VEGFR2 （Tyr1175）调节的均相细胞检测。VEGFR2 介导的信号转导数据可用于血管生成、血管通透性和癌症干细胞调控研究。

规格

其他规格

检测靶标类型	工具箱
品牌	HTRF
治疗领域	心血管 NASH/纤维化神经肿瘤学和炎症
单位面积	50,000 个检测点

运作方式

磷酸化 VEGFR2 （Tyr1175）检测原理

磷酸化 VEGFR2 （Tyr1175）检测可测量在 Tyr1175 位点被磷酸化的 VEGFR2。与 Western Blot 相反，该检测完全基于板，不需要凝胶、电泳或转移。磷酸化 VEGFR2 （Tyr1175）检测使用 2 种标记抗体：一种具有供体荧光团，另一种具有受体。选择第一种抗体是因为它与蛋白质上的磷酸化基序特异性结合，第二种抗体是因为它能够独立于其磷酸化状态识别蛋白质。蛋白质磷酸化能够形成涉及标记抗体的免疫复合物，并使供体荧光团靠近受体，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中存在的磷酸化蛋白浓度成正比，并提供了一种在免洗检测形式下评估蛋白质磷酸化状态的方法。

Phospho-VEGFR2 （Tyr1175） 2 板检测方案

2 板方案包括裂解前在 96 孔板中培养细胞，然后将裂解物转移到 384 孔低体积检测板中，然后添加磷酸化 VEGFR2 （Tyr1175）HTRF 检测试剂。该协议可以监测细胞的活力和汇合度。

Phospho-VEGFR2 （Tyr1175） 1 板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 VEGFR2 可以在用于培养、刺激和裂解的单个板中进行。无需清洗步骤。这种 HTS 设计的方案可实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

人 VEGF 刺激 Huvec 细胞导致酪氨酸 1175 残基上 VEGFR2 蛋白的磷酸化

将 HUVEC 细胞以各种细胞密度接种在 96 孔板上。在 37°C 和 5% CO2 下孵育过夜后，在 37°C 和 5% CO2 下加入人 VEGF 连续稀释液 3 分钟。从细胞中去除刺激培养基，并在细胞中加入 50 μL 裂解缓冲液。通过轻轻摇晃 30 分钟来完成裂解步骤。将 16 μL 样品转移至 384 孔小体积板中，然后加入 4 μL 磷酸化 VEGFR2 HTRF 检测试剂。信号是在一夜之间记录下来的。检测窗口随着细胞密度的增加而增加。

磷酸化 VEGFR2 Tyr1175 细胞测定中 VEGF 的刺激动力学

将 HUVEC 细胞以 100,000 个细胞/孔的密度接种在 96 孔板上。在 37°C 和 5% CO2 下孵育过夜后，在 37°C 和 5% CO2 下连续稀释人 VEGF 不同时间。从细胞中去除刺激培养基，并在细胞中加入 50μL 裂解缓冲液。通过轻轻摇晃 30 分钟来完成裂解步骤。将 16 μL 样品转移至 384 孔小体积板中，然后加入 4 μL 磷酸化 VEGFR2 HTRF 检测试剂。信号是在一夜之间记录下来的。短刺激时间对于最佳测定窗口更有效。

HTRF 检测与使用 Huvec 细胞的磷酸化 VEGFR2 细胞检测的蛋白质印迹的比较

人 HUVEC 细胞培养至 80% 汇合度。hVEGF 处理 3 分钟后，裂解细胞，离心收集可溶性上清液。对细胞裂解物进行连续稀释，将每种稀释液的 16 μL 转移至 384 孔小体积白色微孔板中，最后加入 VEGFR2 细胞试剂盒检测试剂。并排比较表明，HTRF 总测定法比 Western Blot 敏感至少 32 倍。

简化的途径

VEGFR2 信号通路

血管内皮生长因子（VEGF）是一种内皮特异性有丝分裂原因子，通常与肿瘤诱导的血管生成的激活有关。在肿瘤中，VEGF 分泌上调。在内皮细胞表面，分泌的蛋白质以高亲和力与至少两种不同的血管内皮生长因子受体（VEGFR）结合，即 VEGFR-1，也称为 fms 样酪氨酸激酶（Flt-1）和 VEGFR-2，也称为胎肝激酶（Flk-1）。VEGF 激活内皮细胞导致受体自磷酸化和随后的信号传导。已经描述了多个磷酸化位点。VEGFR 与血管生成有关，VEGF 和 PDGF 信号转导的联合抑制会促进肿瘤血管消退

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