HTRF (H/M) NRF2 TOTAL KIT - 500 PTS HTRF人源总核转录因子红系2相关因子2检测试剂盒，500测试

概述

规格

其他规格

• 应用领域：细胞信号传导
• 品牌：HTRF
• 检测方式：均相时间分辨荧光（HTRF）
• 裂解缓冲液兼容性：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 2、裂解缓冲液 3、裂解缓冲液 4
• 分子修饰类型：总量
• 产品类别：试剂盒
• 样本体积：16 微升
• 运输条件：干冰运输
• 作用靶点类别：磷酸化蛋白
• 作用靶点物种：人类、小鼠
• 技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
• 包装规格：500 个检测点
• 视频库

工作原理

HTRF 人源和小鼠源总 NRF2 检测原理

HTRF 人 / 小鼠总 NRF2 检测方法可量化细胞裂解物中 NRF2 的表达水平。与蛋白质免疫印迹法（Western Blot）不同，该检测方法完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。人源总 NRF2 检测使用两种标记抗体，一种与供体荧光团偶联，另一种与受体荧光团偶联。这两种抗体对蛋白质上不同的表位都具有高度特异性。当细胞提取物中存在 NRF2 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团紧密接近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样品中存在的蛋白质浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质表达的方法

。

人源和小鼠源总 NRF2 双板检测方案

双板检测方案包括先在 96 孔板中培养细胞，细胞裂解后，将裂解物转移到 384 孔低体积检测板中，然后再加入人 / 小鼠总 NRF2 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

人源和小鼠源总 NRF2 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测人源 NRF2 可以在用于细胞培养、刺激和裂解的单个微孔板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案在实现小型化的同时，仍能保持可靠的 HTRF 检测质量。

检测验证

化合物诱导的 NRF2 释放

正如预期的那样，这些化合物诱导了 NRF2 从 Keap1 上的释放，且 NRF2 信号水平呈剂量依赖性增加，不同化合物的半最大效应浓度（EC50）如下：Ki696 为 38 纳摩尔，毒胡萝卜素为 0.3 微摩尔，tBHQ 为 29 微摩尔。

不同人源和小鼠源细胞系中 NRF2 水平的评估

将贴壁的人源和小鼠源细胞（Hep-G2、HEK-293、HAP1 和 NIH 3T3 细胞）以每孔 100,000 个或 200,000 个细胞的密度接种于 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，在 37°C 条件下用 tBHQ 处理细胞 16 小时，然后在室温下轻柔摇晃，用补充后的裂解缓冲液 #1 进行细胞裂解。接下来，将 16 微升裂解物转移到 384 孔低体积白色微孔板中，然后加入 4 微升 HTRF 总 NRF2 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

HTRF 总 NRF2 检测方法的特异性评估

HAP1 NRF2 基因敲除细胞未检测到信号，而在野生型 HAP1 细胞中检测到了信号，从而证明了该检测方法对 NRF2 蛋白的特异性。

HTRF 人源总 NRF2 检测方法与蛋白质免疫印迹法（Western Blot）的比较

在这些条件下，HTRF 总 NRF2 检测方法的灵敏度是蛋白质免疫印迹法技术的 4 倍。

简化的信号通路

NRF2 信号通路

受 KEAP1 调控的 NRF2 在细胞应激状态下会发生磷酸化，这使得它能够从 KEAP1 蛋白上释放出来。游离的 NRF2 会转移到细胞核中。Nrf2 转录因子会激活多个具有细胞保护作用的基因的转录，其中包括 p62SQSTM1 基因，该基因与预防癌症和 NDD 有关。这两种蛋白质是自噬通路的重要调节因子。