HTRF EGFR TOTAL KIT - 500 PTS 总表皮生长因子受体检测试剂盒 - 500测试

总 EGFR L858R 测定原理

HTRF 总 EGFR L858R 检测可定量细胞裂解物中突变的 EGFR L858R 的表达水平。与 Western Blot 不同，该检测完全基于板，不需要凝胶、电泳或转印。总 EGFR 突变体 L858R 检测使用两种标记抗体：一种与供体荧光基团偶联，另一种与受体偶联。两种抗体对蛋白质上的不同表位都具有高度特异性。在细胞提取物中存在 EGFR 突变体 L858R 的情况下，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体紧密接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中存在的蛋白质浓度成正比，并提供了一种在免洗检测形式下评估蛋白质表达的方法。

总 EGFR L858R 两板测定方案

两板方案包括在裂解前在 96 孔板中培养细胞，然后将裂解物转移到 384 孔低体积检测板中，然后加入 Total-EGFR L858R HTRF 检测试剂。该协议可以监测细胞的活力和汇合度

总 EGFR L858R 单板测定方案

使用 HTRF 试剂检测总 EGFR 突变体 L858R 可以在用于培养、刺激和裂解的单个板中进行。无需清洗步骤。这种 HTS 设计的方案可实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

总 EGFR L858R 检测已在相关 EGFR 突变细胞系中得到验证。

使用 HTRF 总 EGFR DEL19 试剂盒评估不同细胞系中 EGFR L858R 总表达水平：H1975 和 H3255 细胞（表达 EGFR L858R 突变体）、A431 和 A549 细胞（表达野生型 EGFR）以及 H1650 和 HCC827（表达 EGFR DEL19 突变体）。

将不同的细胞系置于 T175 培养瓶中，置于 37°C、5% CO2 的完全培养基中培养。孵育 48 小时后，在 RT 中用 3 mL 添加的裂解缓冲液 #4 （1X） 在室温下轻轻摇动裂解细胞 30 分钟。将 16 μL 稀释的每种裂解物（按 2 稀释）转移至低容量白色微孔板中，然后加入 4 μL HTRF 总 EGFR L858R 检测试剂。

正如预期的那样，在 H1650、HCC827、A431 和 A549 细胞系中未检测到信号，证明了 HTRF 总 EGFR L858R 试剂盒仅检测突变 EGFR L858R 的特异性。

HTRF 总 EGFR L858R 测定与 Western Blot 的比较

H1975 细胞在 T175 培养瓶中，在 37°C、5% CO2 的完全培养基中培养。孵育 48 小时后，在 RT 中用 3 mL 添加的裂解缓冲液 #4 （1X） 在室温下轻轻摇动裂解细胞 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行连续稀释，在加入 4 μL HTRF 总 EGFR L858R 检测试剂之前，将每种稀释液的 16 μL 转移到低体积白色微孔板中。使用等量的裂解物对 HTRF 和 Western Blot 进行并排比较。

在这些情况下，HTRF 总 EGFR L858R 检测的灵敏度是 Western Blot 技术的 17 倍。

总 EGFR 信号通路

EGFR 是一种受体酪氨酸激酶，属于 ErbB 家族。EGFR 配体的结合驱动受体同源二聚化或异源二聚化，导致 EGFR 酪氨酸激酶结构域和特异性酪氨酸残基的激活。

然后，磷酸化酪氨酸残基为诱导多个信号转导级联反应下游激活的各种因子提供停靠位点。

从 EGF 受体传递到细胞核的信号导致各种生物功能的调节，例如细胞增殖、分化、存活、粘附、迁移和血管生成。

导致 EGFR 过表达或多动的突变与许多癌症有关，使 EGFR 成为抗癌治疗的关键靶点。