HTRF (H/M) STAT6 TOTAL KIT - 500 PTS HTRF人源/鼠源全信号转导和转录激活因子6检测试剂盒，500测试

概述

规格

其他规格

• 应用领域：细胞信号传导
• 品牌：HTRF
• 检测方式：均相时间分辨荧光（HTRF）
• 裂解缓冲液兼容性：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 2、裂解缓冲液 4
• 分子修饰类型：总量
• 产品类别：试剂盒
• 样本体积：16 微升
• 运输条件：干冰运输
• 作用靶点类别：磷酸化蛋白
• 作用靶点物种：人类、小鼠
• 技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
• 包装规格：500 个检测点

工作原理

总 STAT6 检测原理

总 STAT6 检测方法可量化细胞裂解物中 STAT6 的表达水平。与蛋白质免疫印迹法（Western Blot）不同，该检测方法完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 STAT6 检测使用两种标记抗体：一种与供体荧光团偶联，另一种与受体荧光团偶联。这两种抗体对蛋白质上不同的表位都具有高度特异性。当细胞提取物中存在 STAT6 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团紧密接近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样品中存在的蛋白质浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质表达的方法。

总 STAT6 双板检测方案

双板检测方案包括先在 96 孔板中培养细胞，细胞裂解后，将裂解物转移到 384 孔低体积检测板中，然后再加入总 STAT6 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 STAT6 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 STAT6 可以在用于细胞培养、刺激和裂解的单个微孔板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案在实现小型化的同时，仍能保持可靠的 HTRF 检测质量。

检测验证

在人源和小鼠源细胞系中对总 STAT6 的检测

HTRF 总 STAT6 检测方法能够有效地检测在不同表达水平的各种细胞模型中的 STAT6 蛋白。

使用基因敲除的 HAP1 细胞系验证 HTRF 总 STAT6 检测方法的特异性

使用 HTRF 总 STAT6 试剂盒评估 HAP1 细胞（野生型）和 STAT6 基因敲除的 HAP1 细胞系中 STAT6 的表达水平。将细胞以每孔 200,000、100,000、50,000 和 25,000 个细胞的密度接种于 96 孔微孔板中，并在 37°C、5% 二氧化碳的条件下培养 24 小时。去除培养基后，用 50 微升补充后的裂解缓冲液 #4（1 倍稀释液）裂解细胞。然后将 16 微升细胞裂解物转移到低体积白色微孔板中，接着加入 4 微升预混的检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

在 HeLa 细胞系中刺激磷酸化 STAT6（酪氨酸 641 位点）

正如预期的那样，得到的结果显示，在用 hIL4 处理后，STAT6（酪氨酸 641 位点）的磷酸化水平呈剂量反应性增加，而 STAT6 的表达水平保持不变。

在 HeLa 细胞系中抑制磷酸化 STAT6（酪氨酸 641 位点）

正如预期的那样，得到的结果显示，在用鲁索替尼或 JAK 抑制剂 1 处理后，STAT6（酪氨酸 641 位点）的磷酸化水平呈剂量反应性抑制，而 STAT6 的表达水平保持不变。

HTRF 总 STAT6 检测方法与蛋白质免疫印迹法（Western Blot）的比较

使用 HTRF 总 STAT6 检测方法时，每孔 300 个细胞就足以检测到明显的信号，而使用蛋白质免疫印迹法结合电化学发光（ECL）检测则需要 20,000 个细胞。因此，在这些条件下，HTRF 总 STAT6 检测方法的灵敏度是蛋白质免疫印迹法技术的 60 倍。

简化的信号通路

STAT6 的功能和调控

STAT6 在细胞因子和生长因子的作用下，会被受体相关激酶 JAK 磷酸化。一旦发生磷酸化，STAT6 蛋白会形成同源或异源二聚体，并转移到细胞核中，在那里它们介导细胞因子诱导的基因表达。白细胞介素 4 是主要触发 STAT6 在酪氨酸 641 残基上磷酸化的细胞因子，并诱导 BCL2L1/BCL-X (L) 的表达，而 BCL2L1/BCL-X (L) 负责白细胞介素 4 的抗凋亡活性。在较小程度上，已证明 TBK1 对 STAT6 的磷酸化与 STING 通路相关，因此在对病毒感染的先天免疫反应中发挥作用。