HTRF ADV.ERK P-T202/Y204 KIT - 500 PTS 高灵敏度磷酸化ERK测量试剂盒-500测试

概述

Advanced Phospho-ERK检测试剂盒旨在通过Thr202/Tyr204位点的ERK磷酸化定量分析，作为MAPK信号通路的灵敏检测手段。其"混合即读"（mix-and-read）操作流程无需洗涤步骤，可快速获得高质量数据。Total-ERK1/2检测试剂盒与磷酸化检测试剂盒的缓冲液体系兼容，可同步分析同一裂解液中的总蛋白及磷酸化蛋白水平。本产品特别适用于GPCR和RTK靶点的高通量筛选。

技术参数

工作原理

高级磷酸化 ERK（苏氨酸 202 / 酪氨酸 204）检测原理

高级磷酸化 ERK（苏氨酸 202 / 酪氨酸 204）检测方法用于测量在苏氨酸 202 / 酪氨酸 204 位点发生磷酸化的 ERK。与蛋白质免疫印迹法（Western Blot）不同，该检测方法完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。高级磷酸化 ERK（苏氨酸 202 / 酪氨酸 204）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。选择第一种抗体是因为它能特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，选择第二种抗体是因为它能够识别该蛋白质，且与蛋白质的磷酸化状态无关。蛋白质磷酸化会促使形成涉及两种标记抗体的免疫复合物，这使得供体荧光团与受体荧光团紧密接近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样品中存在的磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质磷酸化状态的方法。

高级磷酸化 ERK（苏氨酸 202 / 酪氨酸 204）双板检测方案

双板检测方案包括先在 96 孔板中培养细胞，细胞裂解后，将裂解物转移到 384 孔低体积检测板中，然后再加入磷酸化 ERK（苏氨酸 202 / 酪氨酸 204）HTRF（均相时间分辨荧光）检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

高级磷酸化 ERK（苏氨酸 202 / 酪氨酸 204）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 ERK（苏氨酸 202 / 酪氨酸 204）可以在用于细胞培养、刺激和裂解的单个微孔板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案在实现小型化的同时，仍能保持可靠的 HTRF 检测质量。

检测验证

与蛋白质免疫印迹法相比，高级磷酸化 ERK 检测具有独特的灵敏度

将人胚肾 293（HEK293）细胞培养 48 小时。然后用 50 nM 的表皮生长因子（EGF）刺激细胞 5 分钟。去除培养基并裂解细胞后，收集细胞裂解物并离心 10 分钟。进行系列稀释，并同时用蛋白质免疫印迹法和 HTRF 高级磷酸化 ERK 检测方法进行分析。使用 HTRF 高级磷酸化 ERK（苏氨酸 202 / 酪氨酸 204）检测时，仅 300 个细胞就足以检测到最小信号，而使用蛋白质免疫印迹法则需要 10,000 个细胞才能检测到信号。HTRF 高级磷酸化 ERK 检测方法的灵敏度至少比蛋白质免疫印迹法高 30 倍，并且显示出极佳的相关性。

无需刺激即可检测抑制剂对基础磷酸化 ERK 的剂量反应

高级磷酸化 ERK 检测方法能够在无需激活信号通路的情况下，研究丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路抑制剂化合物对基础激活水平的影响。由于其高度的交叉反应性，高级磷酸化 ERK 检测方法与多种不同的模型物种高度兼容，包括人类、小鼠、大鼠、狗、猴子、仓鼠、水貂、牛、猪、果蝇和斑马鱼。所有实验均使用针对贴壁细胞的双板检测方案进行。接种细胞一天后，将所有细胞系在 37°C、5% 二氧化碳的条件下用相应的抑制剂处理 30 分钟。

在糖尿病模型和患者血细胞中对磷酸化 ERK 的调节作用

高级磷酸化 ERK 检测试剂盒非常适合监测胰腺 β 细胞系或患者外周血单个核细胞（PBMC）中激动剂的刺激作用。实验在两种胰腺 β 细胞系 Ins-1E 和 Min6 上进行。采用双板检测方案。两种细胞系均以每孔 70,000 个细胞的密度接种，培养 4 天。洗涤细胞后，用不含葡萄糖的 Krebs-Ringer 缓冲液孵育细胞。饥饿 2 小时后，用葡萄糖刺激细胞。将 PBMC 以每孔 100,000 个细胞的密度加入孔中，然后在 37°C、5% 二氧化碳的条件下用佛波酯（PMA）刺激 30 分钟。

在肿瘤异种移植模型中对磷酸化 ERK 的灵敏检测

从裸鼠体内切除人胰腺癌细胞系 BxPC-3 的肿瘤异种移植物，研磨并裂解。离心后，收集可溶性部分，并在使用 HTRF 高级磷酸化 ERK 检测试剂盒试剂进行检测之前进行系列稀释。

优化用于磷酸化 ERK 检测的细胞密度

由于高级磷酸化 ERK 检测方法具有高灵敏度，当预期 ERK 磷酸化水平较高时，建议使用标准细胞系的低密度细胞进行实验，以确保在试剂盒的线性范围内操作并实现最佳的信号背景比（S/B）。使用针对贴壁细胞的双板检测方案，在 HEK293 细胞上进行剂量反应实验，分别使用表皮生长因子受体（EGFR）激动剂 EGF 或小分子 Raf 激酶抑制剂 L779-450 进行处理。将细胞以每孔 25,000、50,000 或 100,000 个细胞的密度接种，在 37°C、5% 二氧化碳的条件下培养 24 小时。

Gαq/i 偶联受体的激活

使用磷酸化 ERK 细胞检测的双板检测方案，对用趋化因子 RANTES 和巨噬细胞炎症蛋白 - 1β（MIP-Iβ）激活 10 分钟的中国仓鼠卵巢细胞（CHO）-CCR5 细胞（25,000 个细胞）进行实验，得到相应结果。

筛选的稳健性

在室温下，用卡巴胆碱刺激中国仓鼠卵巢细胞（CHO）-M1 细胞（每孔 5,000 个细胞，384 孔小体积板）10 分钟。计算未刺激细胞（基础水平）与两种选定的卡巴胆碱浓度（1.3 µM 和 4 µM，分别对应于 80% 最大效应浓度（EC80）和 100% 最大效应浓度（EC100））之间五十次重复实验的 Z' 值。使用磷酸化 ERK 检测试剂盒的单板检测方案，在 CyBio™公司的自动化机器人系统（配备 384/25 µL 移液头的 CyBivario）上进行检测。使用 PHERAStar Plus（BMG Labtech 公司）读取结果。

总 ERK1/2 检测以控制 ERK1/2 的磷酸化

使用磷酸化 ERK1/2 和总 ERK1/2 检测的双板检测方案，用 EGF 刺激人表皮癌细胞系 A431 细胞（每孔 100,000 个细胞）10 分钟。正如预期的那样，得到的结果显示，在 EGF 刺激下，ERK1/2 的磷酸化水平呈剂量反应性增加，而 ERK1/2 的表达水平保持不变。

简化的信号通路

MAPK/ERK 细胞信号传导

MAPK/ERK 信号级联可被多种参与细胞生长和分化的受体激活。核心信号转导级联可引发对众多细胞过程的调节，包括细胞粘附、迁移、凋亡、分化和代谢。MEK1/2 催化 ERK1/2 在酪氨酸 204 和苏氨酸 202 位点的磷酸化。作为响应，ERK 会磷酸化数百种细胞质和细胞核底物。MAPK 信号传导的高度复杂性和多样性使得 ERK 成为生物学中的关键调节因子和主要信号节点。

ERK 在 G 蛋白偶联受体（GPCR）信号传导中的作用