HTRF CRAF TOTAL KIT - 10K PTS HTRF总C-RAF原癌基因丝苏氨酸蛋白激酶检测试剂盒，10,000测试

总 cRaf 测定原理

总 cRaf 检测可定量细胞裂解物中 cRaf 的表达水平。与 Western Blot 不同，该检测完全基于板，不需要凝胶、电泳或转印。总 cRaf 检测使用两种标记抗体，一种与供体荧光基团偶联，另一种与受体偶联。两种抗体对蛋白质上的不同表位都具有高度特异性。在细胞提取物中存在 eNOS 的情况下，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体紧密接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中存在的蛋白质浓度成正比，并提供了一种在免洗检测形式下评估蛋白质表达的方法。

TotalcRaf 两板检测方案

两板方案包括在裂解前在 96 孔板中培养细胞。然后将裂解物转移到 384 孔低体积检测板中，然后加入 HTRF 总 cRaf 检测试剂。该协议可以监测细胞的活力和汇合度。

总 cRaf 单板测定方案

使用 HTRF 试剂检测总 eNOS 可以在用于培养、刺激和裂解的单个板中进行。无需清洗步骤。这种 HTS 设计的方案可实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

TPA 刺激的 HeLa 细胞中的总细胞和磷酸化 c-RAF （S43） 检测

将 HeLa 细胞接种在 96 孔板（100,000 个细胞/孔）中的完全培养基中，并在 37°C、5% CO2 下孵育过夜。第二天，去除培养基，加入 50 μl 无血清培养基，在 37°C、5% CO2 下饥饿细胞 5 小时。然后用 50 μl 浓度递增的 TPA 在 37°C、5% CO2 下处理细胞 15 分钟。

去除培养基后，然后在室温下轻轻摇动，用 50 μL 补充的裂解缓冲液 #2 裂解细胞 30 分钟，并将 16 μL 裂解物转移到低容量白色微孔板中，然后加入 4 μL 预混 HTRF 磷酸化 cRaf （Ser43） 或总 cRaf 检测试剂。ON 孵育后记录 HTRF 信号。

TPA 刺激的 HEK293T 细胞中的总细胞和磷酸化 c-RAF （S43） 检测

将HEK293T细胞接种在 96 孔板（100,000 个细胞/孔）中，溶于完全培养基中，并在 37°C、5% CO2 下孵育过夜。第二天，去除培养基，加入 50 μl 无血清培养基，在 37°C、5% CO2 下饥饿细胞 5 小时。然后用 50 μl 浓度递增的 TPA 在 37°C、5% CO2 下处理细胞 15 分钟。

去除培养基后，然后在室温下轻轻摇动，用 50 μL 补充的裂解缓冲液 #2 裂解细胞 30 分钟，并将 16 μL 裂解物转移到低容量白色微孔板中，然后加入 4 μL 预混 HTRF 磷酸化 cRaf （Ser43） 或总 cRaf 检测试剂。ON 孵育后记录 HTRF 信号。

RSK1 的功能和调节

RAF 原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 （c-RAF） 是 MAP 激酶通路的一部分，它将上游效应子 Ras 连接到下游 MAPK/ERK 级联反应。因此，它在细胞命运决定中发挥作用，包括增殖、分化、凋亡、存活和致癌转化。

c-RAF 被 PKC 直接或间接作用的 Ser338 磷酸化激活，或被 GTP 结合的 Ras 直接激活。通过 MAPK/ERK 依赖性反馈在 Ser43 位点的磷酸化确保失活。