HTRF STAT1 P-Y701 KIT - 50K PTS

概述

这种基于HTRF细胞的检测方法能够快速、定量地检测酪氨酸701（Tyr701）位点磷酸化的STAT1，以此作为JAK/STAT信号通路活性的读数。STAT1是一种重要的转录激活因子，该检测可作为肿瘤学、病毒学和炎症研究中JAK抑制剂的检测指标。工作原理

磷酸化STAT1（Tyr701）检测原理 磷酸化STAT1（Tyr701）检测用于测量Tyr701位点磷酸化的STAT1。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化STAT1（Tyr701）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生FRET（荧光共振能量转移）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。 磷酸化STAT1（Tyr701）双板检测方案 双板方案包括先在96孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至384孔小体积检测板，再加入磷酸化STAT1（Tyr701）HTRF检测试剂。此方案可监测细胞的活力和汇合度。 磷酸化STAT1（Tyr701）单板检测方案 使用HTRF试剂检测磷酸化STAT1（Tyr701）可在同一板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的HTRF质量。 检测验证 在人HeLa细胞上使用磷酸化STAT1细胞检测的HTRF方法与蛋白质印迹法的比较 将HeLa细胞在T175培养瓶中于37°C、5% CO₂条件下培养48小时。然后用干扰素α（IFNα）刺激细胞20分钟。移除培养基后，加入3mL补充的裂解缓冲液，在室温下裂解细胞30分钟。离心10分钟后收集可溶性组分。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取16µL各稀释液，分别通过蛋白质印迹法和HTRF方法进行平行分析。在每个测试的细胞密度下，荧光比率与蛋白质印迹条带强度高度匹配，表明HTRF作为测量磷酸化STAT1的分析技术具有可靠性。 在人和小鼠细胞系上对磷酸化STAT1-Y701的验证 使用IFNα诱导小鼠NIH 3T3细胞和人HeLa细胞中STAT1的磷酸化。将不同细胞密度的NIH-3T3和HeLa细胞接种后，用2.5µg/mL的IFNα刺激20分钟。加入50µL补充的裂解缓冲液裂解细胞后，将16µL裂解物转移至384孔小体积白色微孔板中，然后加入4µL HTRF磷酸化STAT1检测试剂。过夜孵育后记录HTRF信号。图表显示了IFNα刺激组与未刺激组之间的生物学检测窗口。 在HeLa细胞上检测磷酸化STAT1：刺激动力学 使用IFNα诱导HeLa细胞中STAT1的磷酸化。将200,000个细胞接种到96孔板中，然后用不同浓度的IFNα分别刺激10、20、30和60分钟。加入50µL补充的裂解缓冲液裂解细胞后，将16µL裂解物转移至384孔小体积白色微孔板中，然后加入4µL HTRF磷酸化STAT1检测试剂。过夜孵育后记录HTRF信号。在这些实验条件下，确定IFNα的最佳刺激时间为20分钟。 使用HTRF总STAT1检测验证小鼠和人细胞上STAT1的磷酸化状态 用不同浓度的IFNα刺激20分钟后，将NIH 3T3和HeLa细胞（200,000个细胞/96孔板）用50µL补充的裂解缓冲液裂解，在室温下轻轻振荡孵育30分钟。对于磷酸化STAT1检测（蓝色曲线），将16µL裂解物转移至384孔小体积白色微孔板中，然后加入4µL HTRF磷酸化STAT1检测试剂；对于总STAT1检测（红色曲线），将16µL裂解物转移至384孔小体积白色微孔板中，然后加入4µL HTRF总STAT1检测试剂。过夜孵育后记录HTRF信号。注意，与NIH3T3细胞相比，HeLa细胞对IFNα的敏感性更高。 简化通路 参与JAK/STAT通路的转录激活因子STAT1 STAT1是参与JAK/STAT通路的重要转录激活因子，该通路可被I型干扰素、生长因子或趋化因子激活。刺激后，磷酸化的STAT1二聚体与干扰素刺激基因因子3复合物结合。随后，STAT1蛋白转运至细胞核，激活与细胞存活、活力或病原体应答相关的基因转录。在干扰素γ（IFNγ）作用下，STAT1形成同源二聚体或与STAT3形成异源二聚体，结合到γ干扰素激活序列（GAS）启动子元件上。在IFNα或IFNβ作用下，STAT1与STAT2形成异源二聚体，结合到干扰素刺激应答元件（ISRE）上。规格参数

其他规格 应用领域：细胞信号传导 品牌：HTRF 检测方式：HTRF 分子修饰：磷酸化 产品类别：试剂盒 样品体积：16µL 运输条件：干冰运输 目标类别：磷酸化蛋白质 目标物种：人、小鼠 技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET） 治疗领域：传染病、神经科学、肿瘤学/炎症 单位规格：50,000个检测点