HTRF HISTONE H3 P-T3 KIT - 50K PTS

概述

磷酸化组蛋白H3（T3）检测可用于检测组蛋白H3尾部的T3磷酸化情况，组蛋白H3是基因表达和有丝分裂的关键调控因子。苏氨酸3（Threonine 3）位点的磷酸化由组蛋白H3激酶（haspin）催化，在许多物种中高度保守，该过程会招募极光激酶B（AURKB）和染色体乘客复合物（CPC）到动粒，从而调控有丝分裂。工作原理

磷酸化组蛋白H3（Thr3）检测原理 磷酸化组蛋白H3（Thr3）检测用于测量Thr3位点磷酸化的组蛋白H3。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化组蛋白H3（Thr3）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生FRET（荧光共振能量转移）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。 1assay-principle.svg（检测原理图示1） 磷酸化组蛋白H3（Thr3）双板检测方案 双板方案包括先在96孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至384孔小体积检测板，再加入磷酸化组蛋白H3（Thr3）HTRF检测试剂。此方案可监测细胞的活力和汇合度。 2assay-protocol.svg（检测方案图示2） 磷酸化组蛋白H3（Thr3）单板检测方案 使用HTRF试剂检测磷酸化组蛋白H3（Thr3）可在同一板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的HTRF质量。 3plate-protocol.svg（检测方案图示3）检测验证

磷酸化组蛋白H3（Thr3）的HTRF检测与蛋白质印迹法的比较 将人宫颈癌HeLa细胞培养至80%汇合度。经花萼海绵诱癌素A（Calyculin A）处理后，裂解细胞，离心10分钟后收集可溶性组分。对细胞裂解物进行系列稀释，取各稀释液分别通过蛋白质印迹法和HTRF方法进行平行分析。结果显示，HTRF磷酸化组蛋白H3（Thr3）检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的16倍。 4phospho-t3-1.png（磷酸化T3相关图片1） 在小鼠和人细胞上对磷酸化组蛋白H3（Thr3）的HTRF验证检测 将50,000个人宫颈癌HeLa细胞或小鼠成纤维细胞NIH-3T3接种到96孔板中，在37°C、5% CO₂条件下孵育24小时。在37°C条件下，用不同浓度的花萼海绵诱癌素A刺激细胞30分钟。然后移除培养基，加入50µl裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡30分钟裂解细胞。将16µL裂解物转移至384孔小体积白色微孔板中，加入4µL HTRF磷酸化组蛋白H3（Thr3）检测试剂。在室温下孵育2小时后记录HTRF信号。 5phospho-t3-2.svg（磷酸化T3相关图示2） 6phospho-t3-3.svg（磷酸化T3相关图示3） 简化通路 细胞信号中的磷酸化组蛋白H3-Thr3 组蛋白H3的N端尾部有四个已明确的在有丝分裂期间发生磷酸化的位点：Thr3、Ser10、Thr11和Ser28。Thr3的磷酸化与有丝分裂阶段之间存在精确的时空关联：磷酸化在早前期开始于核膜附近，在 prometaphase（前中期）扩散至着丝粒周围染色质，并在晚后期完全逆转。Thr3的磷酸化在许多物种中高度保守，由组蛋白H3激酶（Haspin）催化。Thr3的磷酸化随后为染色体乘客复合物（CPC）的募集提供染色质结合位点，该复合物由四种蛋白质组成：与H3结合的生存素（Survivin）、极光激酶B（Aurora-B）、INCEMP和 borealin（北冕蛋白）。极光激酶B进而磷酸化组蛋白H3激酶，形成信号放大环路，促进染色体乘客复合物在着丝粒处积累，以调控有丝分裂和染色体分离。其去磷酸化由PP1-γ/Repo-Ma复合物催化。 7peh-63adk061pey.svg（相关通路图示）规格参数

其他规格 - 应用领域：细胞信号传导 - 品牌：HTRF - 检测方式：HTRF - 分子修饰：磷酸化 - 产品类别：试剂盒 - 样品体积：16µL - 运输条件：干冰运输 - 目标类别：磷酸化蛋白质 - 目标物种：人、小鼠 - 技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET） - 治疗领域：神经科学 - 单位规格：50,000个检测点