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HTRF P-LAMBAN P-T17 KIT - 50K PTS

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概述


这种基于细胞的检测方法能够检测苏氨酸 17 位点磷酸化的受磷蛋白（PLN）。该磷酸化检测方法与总 PLN 检测方法相结合，是监测 CaMKII 激活的理想选择。细胞内 Ca²⁺浓度的增加会激活 CaMKII，进而使 PLN 的 Thr17 残基磷酸化。去磷酸化的 PLN 会抑制 SERCA2a，而 PKA 使 PLN 的 Ser16 位点磷酸化或 CaMKII 使 Thr17 位点磷酸化，则会逆转这种对 SERCA2a 的抑制作用。PLN 的磷酸化状态可调节这种 Ca²⁺泵的活性。


工作原理


磷酸化受磷蛋白（Thr17）检测原理
磷酸化受磷蛋白（Thr17）检测用于测量在 Thr17 位点发生磷酸化的受磷蛋白。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化受磷蛋白（Thr17）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成涉及两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，并且在无需洗涤的检测格式下，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了一种方法。


磷酸化受磷蛋白（Thr17）双板检测方案
双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后再加入磷酸化受磷蛋白（Thr17）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。


磷酸化受磷蛋白（Thr17）单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测磷酸化受磷蛋白（Thr17）可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。


检测验证


心脏匀浆中的磷酸化受磷蛋白检测
使用 Cisbio 裂解缓冲液对自发性高血压（SHR）心脏样本和正常心脏样本进行匀浆处理，离心后收集上清液。将 16µL 裂解物转移到 384 孔 sv 白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化受磷蛋白（Thr17）检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。


简化通路


PLN 的简化通路
受磷蛋白（PLN）通过对心肌肌浆网（SR）Ca²⁺-ATP 酶（SERCA2a）的调控，在心力衰竭中发挥关键作用。该蛋白质在肌浆网膜中含有一种 Ca²⁺泵，一旦被激活，Ca²⁺就会进入肌浆网。SERCA2a 活性不足是心力衰竭的一个特征。去磷酸化的 PLN 会抑制 SERCA2a，而 PKA 使 PLN 的 Ser16 位点磷酸化或 CaMKII 使 Thr17 位点磷酸化，则会逆转对 SERCA2a 的抑制。PLN 的磷酸化状态调节这种 Ca²⁺泵的活性。PLN 的去磷酸化驱动心脏舒张，而其磷酸化状态则驱动心脏收缩。这种小蛋白质存在于心肌、平滑肌和慢肌纤维骨骼肌中。然而，其调节作用主要在心肌中进行了研究。其激活过程尚不完全清楚，但已知有两条主要通路，分别导致两个不同位点的磷酸化：丝氨酸 16 残基或苏氨酸 17 残基。β 受体激动剂与其受体结合会激活 G 蛋白，从而增强腺苷酸环化酶（AC）的活性。腺苷酸环化酶催化环磷酸腺苷（cAMP）的形成，进而激活 PKA。PKA 使 L 型 Ca²⁺通道磷酸化，增加 Ca²⁺内流，并使 PP1 和 PLN 的 Ser16 残基磷酸化。细胞内 Ca²⁺浓度的增加会激活 CaMKII。这种自身磷酸化状态也受 PP1 的调控。CaMKII 进而使 PLN 的 Thr17 残基磷酸化。


规格


其他规格
应用
细胞信号传导
品牌
HTRF
检测方式
HTRF
分子修饰
磷酸化
产品类别
试剂盒
样品体积
16 µL
运输条件
干冰运输
目标类别
磷酸化蛋白
目标物种
人类
技术
时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域
心血管
单位规格
50,000 个检测点


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将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF BRD4 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。


如预期（Raina 等人，《美国国家科学院院刊》，2019 年；Winter 等人，《分子细胞》，2017 年；Nowak 等人，《自然化学生物学》，2018 年），这三种 BRD4 PROTAC 降解剂触发 BRD4 蛋白呈剂量依赖性减少，其 DC50 * 在纳摩尔范围内，而在 ARV-471 对照条件下，BRD4 的表达水平保持稳定。


在相同条件下观察到管家基因 GAPDH 信号降低，表明高浓度 PROTAC 可能诱导细胞毒性。


DC50 指降解剂使 50% 的靶蛋白降解时的浓度。

使用 siRNA 验证 HTRF 总 BRD4 检测的特异性

将 MCF7 细胞以 25,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，培养 24 小时。然后用针对 BRD1/2/3/4/7/9 和 BRDT 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 24 小时后，裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 BRD4 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。


与阴性 siRNA 相比，BRD4 siRNA 使 BRD4 表达水平降低了 56%，而在其他 BRD siRNA 转染的细胞中，HTRF BRD4 信号保持稳定。值得注意的是，在相同条件下，管家基因 GAPDH 信号未发生变化。这些结果共同证明了 HTRF BRD4 检测的特异性和选择性。


使用 siRNA 验证总 BRD4 检测的特异性 ——BRD4


使用 siRNA 验证总 BRD4 检测的特异性 ——GAPDH

HTRF 总 BRD4 检测与蛋白质印迹法的比较

将 MCF7 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，移除细胞培养基，用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。


使用补充的 4 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 BRD4 检测试剂。


使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。


在这些实验条件下，HTRF 总 BRD4 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。


HTRF 总 BRD4 检测与蛋白质印迹法的比较


简化通路

BRD4 信号通路
BRD4 与超乙酰化染色质区域（也称为超级增强子区域）结合，并招募多种转录共激活因子，促进形成一个大型的转录调节蛋白平台。该复合物进一步在超级增强子和启动子之间形成桥梁，NFKB 和其他转录因子（TF）在此结合。最后，P-TEFb 刺激 RNA 聚合酶 II，进而启动包括 c-Myc 或 K-Ras 等癌基因在内的多个基因的转录。


该示意图改编自 Muddassir 等人，《RSC Advances》，2021 年。


pathway-BRD4-total.svg（BRD4 总检测信号通路图）


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