HTRF SLP-76 P-S376 KIT - 50K PTS

概述

这种基于HTRF细胞的检测方法能够快速、定量地检测丝氨酸376上磷酸化的SLP-76。磷酸化的SLP-76会形成一个支架，关键的信号复合物在此基础上构建，它也是T淋巴细胞活化的标志物。工作原理

磷酸化SLP-76（Ser376）检测原理 磷酸化SLP-76（Ser376）检测用于测量在Ser376位点发生磷酸化的SLP-76。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化SLP-76（Ser376）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经选择可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成涉及两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生FRET信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，为在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质磷酸化状态提供了一种手段。 磷酸化SLP-76（Ser376）双板检测方案 双板方案包括先在96孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到384孔小体积检测板中，之后再加入磷酸化SLP-76（Ser376）HTRF检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。 磷酸化SLP-76（Ser376）单板检测方案 使用HTRF试剂检测磷酸化SLP-76（Ser376）可在单个板中进行，该板用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的HTRF质量。 检测验证 在人Jurkat细胞上使用磷酸化SLP-76（Ser376）细胞检测，对HTRF检测与蛋白质印迹法进行比较 Jurkat细胞在添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中，于37°C、5%CO₂环境下，在T175cm²培养瓶中培养2天。取4.5mL细胞悬液（13×10⁶个细胞/mL），用抗CD3抗体（终浓度20μg/mL）刺激2.5分钟。刺激后，在室温下加入2.25mL 4倍浓度的补充裂解缓冲液，裂解细胞30分钟。然后将纯裂解物在相同的补充裂解缓冲液中进行系列稀释。取16μL每种稀释液，分别通过HTRF和蛋白质印迹法进行平行分析。 磷酸化SLP-76（Ser376）的细胞密度优化 细胞密度优化采用双板方案进行。Jurkat细胞以200,000个细胞或400,000个细胞/孔的密度接种在96孔培养板中，每孔25μL，使用含10%FBS的完全RPMI培养基。用不同浓度的抗CD3抗体刺激细胞30分钟。使用10μL 4倍浓度的补充裂解缓冲液进行细胞裂解。取16μL每种细胞裂解物，通过HTRF磷酸化SLP-76（Ser376）检测进行分析。 细胞刺激动力学 该检测采用双板方案进行。将400,000个Jurkat细胞/孔接种在96孔培养板中，每孔25μL，使用含10%FBS的完全RPMI培养基。用终浓度为20μg/mL的抗CD3抗体刺激细胞不同时间（分钟）。刺激后，用10μL 4倍浓度的补充裂解缓冲液裂解细胞。取16μL不同条件下的每种细胞裂解物，通过HTRF磷酸化SLP-76（Ser376）和总SLP-76检测进行分析。 免疫检查点抑制剂PD-L1活性监测 由于磷酸化SLP-76（Tyr376）是T细胞活化的一种读数，因此被用于监测PD-L1重组蛋白对T细胞活化的抑制作用。该检测采用双板检测方案进行。将400,000个Jurkat细胞接种在25μL含10%FBS的完全RPMI培养基中。细胞与不同浓度的PD-L1重组蛋白预孵育24小时。然后用20μg/mL的抗CD3抗体（终浓度）刺激细胞2.5分钟，直接加入10μL 4倍浓度的补充裂解缓冲液裂解细胞，随后在室温下孵育30分钟。取16μL每种样品，使用磷酸化SLP-76（Ser376）和总SLP-76检测进行分析。磷酸化SLP-76的结果以总SLP-76的量进行标准化，并绘制在图表上。 通过磷酸化SLP-76（Ser376）检测发现，终浓度为40μg/mL的PD-L1重组蛋白具有轻微但显著的抑制作用。 简化通路 SLP-76的功能与调节 TCR结合会促使淋巴细胞蛋白酪氨酸激酶（Lck）磷酸化TCR/CD3复合物胞质侧的基于免疫受体酪氨酸的活化基序（ITAMs）。Zap-70被招募到TCR/CD3复合物上，并在此发生磷酸化而活化。ZAP-70使SLP-76磷酸化。活化的SLP-76转移到质膜上，促进形成多蛋白复合物，该复合物参与T淋巴细胞的活化、存活和增殖。规格

其他规格 应用 细胞信号传导 品牌 HTRF 检测方式 HTRF 分子修饰 磷酸化 产品类别 试剂盒 样品体积 16μL 运输条件 干冰运输 目标类别 磷蛋白 目标物种 人 技术 时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET） 治疗领域 肿瘤学与炎症 单位规格 50,000个检测点