HTRF SLP-76 TOTAL KIT - 50K PTS

概述

总SLP-76细胞检测试剂盒旨在监测SLP-76的表达水平，无论其处于磷酸化还是非磷酸化状态。该试剂盒与我们的磷酸化SLP-76（Ser376）试剂盒兼容，能够从单个样本中分析磷酸化蛋白和总蛋白，从而更好地反映T淋巴细胞的活化情况。工作原理

总SLP-76检测原理 总SLP-76检测可对细胞裂解物中SLP-76的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总SLP-76检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在SLP-76时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生FRET（荧光共振能量转移）信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达。 总SLP-76双板检测方案 双板方案包括：先在96孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至384孔小体积检测板，再加入总SLP-76 HTRF检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。 总SLP-76单板检测方案 使用HTRF试剂检测总SLP-76可在单个培养板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的HTRF质量。检测验证

基于人Jurkat细胞的总SLP-76细胞检测：HTRF检测与蛋白质印迹法的比较 将Jurkat细胞在添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中，于37°C、5% CO₂环境下的T175cm²培养瓶中培养2天。取4.5 mL细胞悬液（13×10⁶个细胞/mL），用抗CD3抗体（终浓度20μg/mL）刺激2.5分钟。刺激后，加入2.25 mL 4倍浓度的补充裂解缓冲液，在室温下裂解细胞30分钟。随后将纯裂解物在相同的补充裂解缓冲液中进行系列稀释。取16 µL各稀释液，分别通过HTRF和蛋白质印迹法进行平行分析。 细胞刺激动力学 本检测采用双板方案进行。将Jurkat细胞以每孔400,000个的密度接种到96孔培养板中，每孔25µL，使用含10% FBS的完全RPMI培养基。用终浓度为20μg/mL的抗CD3抗体刺激细胞不同时间（分钟）。刺激后，加入10 µL 4倍浓度的补充裂解缓冲液裂解细胞。取16 µL不同条件下的各细胞裂解物，通过HTRF磷酸化SLP-76（Ser376）和总SLP-76检测进行分析。 免疫检查点抑制剂PD-L1活性监测 由于磷酸化SLP-76（Ser396）是T细胞活化的一个指标，因此被用于监测PD-L1重组蛋白对T细胞活化的抑制作用。本检测采用双板检测方案进行。将400,000个Jurkat细胞接种到25 µL含10% FBS的完全RPMI培养基中。细胞与不同浓度的PD-L1重组蛋白预孵育24小时。然后用20μg/mL的抗CD3抗体（终浓度）刺激细胞2.5分钟，直接加入10 µL 4倍浓度的补充裂解缓冲液裂解细胞，随后在室温下孵育30分钟。取16µL各样本，使用磷酸化SLP-76（Ser376）和总SLP-76检测进行分析。将磷酸化SLP-76的结果以总SLP-76的量进行标准化，并绘制图表。通过磷酸化SLP-76（Ser376）检测发现，终浓度为40μg/mL的PD-L1重组蛋白具有轻微但显著的抑制作用。 简化通路 SLP-76的功能与调控 T细胞受体（TCR）结合会促使淋巴细胞蛋白酪氨酸激酶（Lck）磷酸化TCR/CD3复合物胞质侧的基于免疫受体酪氨酸的活化基序（ITAMs）。Zap-70被招募到TCR/CD3复合物上，并在此发生磷酸化而激活。ZAP-70进而磷酸化SLP-76。活化的SLP-76转移至质膜，促进形成多蛋白复合物，该复合物参与T淋巴细胞的活化、存活和增殖。规格参数

其他规格 - 应用领域：细胞信号传导 - 品牌：HTRF - 检测方式：HTRF - 分子修饰：总量 - 产品类别：试剂盒 - 样品体积：16 µL - 运输条件：干冰运输 - 靶标类别：磷酸化蛋白 - 靶标物种：人 - 技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET） - 治疗领域：肿瘤学与炎症 - 单位规格：50,000个检测点