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HTRF STAT5 P-Y694 KIT - 50K PTS

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概述

磷酸化 STAT5（Tyr694）检测试剂盒旨在稳健且高效地监测 STAT5 在 Tyr694 位点的磷酸化情况，以此作为 JAK/STAT 通路激活的读数指标。该试剂盒采用优化且简化的 “混合即读” 免洗方案，包含研究所需的全部试剂，能让实验更快速、高效地进行。

工作原理

磷酸化 STAT5（Tyr694）检测原理

磷酸化 STAT5（Tyr694）检测可测量在 Tyr694 位点发生磷酸化的 STAT5。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此检测使用两种标记抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，为在免洗检测格式下评估蛋白质磷酸化状态提供了手段。

磷酸化 STAT5（Tyr694）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 STAT5（Tyr694）HTRF 检测试剂。该方案可监测细胞活力和汇合度。

磷酸化 STAT5（Tyr694）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 STAT5（Tyr694）可在同一微孔板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。此高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持稳健的 HTRF 检测质量。

检测验证

基于磷酸化 STAT5（Tyr694）检测试剂盒的 HTRF 与蛋白质印迹法对比

TF1 细胞在 T175 培养瓶中于 37°C 条件下培养，直至细胞浓度达到 1.5×10⁶个 /ml 培养基，随后用 IL3 刺激 10 分钟。细胞裂解孵育 30 分钟后，对系列稀释液（1:2）同时进行 HTRF 检测和蛋白质印迹分析。注意，128KC 大致相当于 32µg 蛋白质。使用 HTRF 磷酸化 STAT5（Tyr694）检测时，仅需 2000 个细胞即可实现最低信号检测，而蛋白质印迹法则需要 8000 个细胞才能产生信号。HTRF 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 4 倍，且具有良好的相关性。

基于磷酸化 STAT5（Tyr694）检测试剂盒的 HTRF 与 ELISA 对比

培养 TF1 细胞，用不同浓度的 JAK 抑制剂处理后，再用 IL3 刺激 10 分钟。裂解后，对收集的上清液进行系列稀释，并同时通过 HTRF 和 ELISA 进行分析。图表结果显示，在测量 STAT5 磷酸化方面，HTRF 比 ELISA 更灵敏，检测窗口更大，重现性更好。尽管 ELISA 与 HTRF 具有良好的相关性，但 HTRF 的整体性能更优。

采用双板方案检测 TF1 细胞的药理学反应

将 TF1 细胞接种在含 25µl 细胞培养基的孔中，用 5µl 不同浓度的 JAK 抑制剂（来他替尼）处理 30 分钟。移除细胞培养基后，加入 10µl 4X 补充裂解缓冲液，孵育 30 分钟后再加入 HTRF 检测试剂。将 16µl 裂解物转移至 384sv 白色板中，用于分析 STAT5 的磷酸化情况。结果清楚表明，该检测具有高灵敏度，可使用少 4 倍的细胞量，且检测窗口不会显著减小。

采用双板方案检测 TF1 细胞的药理学反应

采用双板方案检测 HeLa 细胞的药理学反应

将 100KC HeLa 细胞接种在含 25µl 细胞培养基的孔中，用 5µl 不同浓度的 JAK 抑制剂（来他替尼）处理 2 小时，然后用 20nM IFN 刺激 10 分钟。移除细胞培养基后，加入 10µl 4X 补充裂解缓冲液，孵育 30 分钟后再加入 HTRF 检测试剂。将 16µl 裂解物转移至 384sv 白色板中，用于分析 STAT5 的磷酸化情况。

简化通路

STAT5 细胞信号传导

Stat5 蛋白的激活广泛由细胞因子和其他生长因子介导，可实现信号从细胞膜到细胞核的快速传递。这些 STAT 蛋白以细胞因子特异性的方式调节靶基因的表达。除了被细胞因子激活外，Stat5a 和 Stat5b 的活性还受到 CIS/SOCS/SSI 蛋白的负调控。JAK/STAT 通路的激活需要配体与受体结合，进而激活 Janus 激酶（JAKs）—— 一类胞内酪氨酸激酶。通过磷酸化下游的信号转导和转录激活因子（STAT），STAT5 形成同源或异源二聚体以获得活性并转运至细胞核，在那里结合到 STAT5 应答元件上，诱导特定基因集的转录。

规格

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：传染病、神经科学、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64AT5PEY

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