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HTRF STAT6 P-Y641 KIT - 50K PTS

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概述

这种基于细胞的检测方法旨在监测 STAT6 在 Tyr641 位点的磷酸化，这是其激活的标志性特征。

STAT6 是一种转录因子，主要由 IL4 受体激活，也可由 IL3、IL13 或 IFNα 受体激活。Janus 激酶使 STAT6 的 641 位酪氨酸磷酸化，这会导致其形成同源二聚体或与 STAT2 形成异源二聚体。最终，激活的 STAT6 易位至细胞核，介导细胞因子诱导的基因表达。

工作原理

磷酸化 STAT6（Tyr641）检测原理

磷酸化 STAT6（Tyr641）检测可测量在 Tyr641 位点发生磷酸化的 STAT6。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此检测使用两种标记抗体，一种携带供体荧光团，另一种携带受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且在无需洗涤的检测格式下即可评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 STAT6（Tyr641）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，最后加入磷酸化 STAT6（Tyr641）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

HTRF 总 BRD2 检测的双板方案

磷酸化 STAT6（Tyr641）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 STAT6（Tyr641）可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

HTRF 总 BRD2 检测的单板方案

检测验证

不同细胞模型中 STAT6 Tyr641 磷酸化的评估

多种人类细胞系（包括贴壁的 HeLa 细胞和悬浮细胞，如 TF1、U937 和 TH1 细胞）以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，然后用 5ng/mL 的人 IL4 刺激 20 分钟。用添加了补充剂的裂解缓冲液裂解细胞后，将 16μL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，再加入 HTRF 磷酸化 STAT6（Tyr641）检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

THP1 细胞中磷酸化 STAT6（Tyr641）的药理学验证

将 THP1 细胞以不同密度接种到 96 孔板中，然后用不同浓度的人 IL4 刺激 20 分钟。按照双板检测方案，将 16μL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，再加入 4μL HTRF 磷酸化 STAT6（Tyr641）检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

IFNα 剂量反应诱导的 STAT6 磷酸化

将 THP1 细胞以不同密度接种到 96 孔板中，然后用不同浓度的人 IFNα 刺激 20 分钟。按照双板检测方案，将 16μL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，再加入 4μL HTRF 磷酸化 STAT6（Tyr641）检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

HTRF 磷酸化 STAT6 细胞检测与蛋白质印迹法的比较

将人 HeLa 细胞系接种到 T175 培养瓶中，在 37°C、5% CO₂条件下培养至汇合。然后用 IL4（50ng/mL）处理细胞 20 分钟，随后裂解。用添加了补充剂的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16μL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4μL HTRF 磷酸化 STAT6 检测试剂。取等量裂解物进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行比较。使用 HTRF 磷酸化 STAT6 Y641 检测时，每孔 5,000 个细胞即可检测到信号，而使用电化学发光（ECL）检测的蛋白质印迹法则需要 40,000 个细胞。这些结果表明，HTRF 磷酸化 STAT6 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

简化通路

STAT6 的功能与调控

在细胞因子和生长因子的作用下，与受体相关的 JAK 激酶使 STAT6 磷酸化。磷酸化后的 STAT6 蛋白形成同源二聚体或异源二聚体，并易位至细胞核，介导细胞因子诱导的基因表达。白细胞介素 4（IL4）是触发 STAT6 的 641 位酪氨酸磷酸化的主要细胞因子，它可诱导 BCL2L1/BCL-X (L) 的表达，而该基因负责 IL4 的抗凋亡活性。在较小程度上，已有研究表明 TBK1 介导的 STAT6 磷酸化与 STING 通路相关，因此在应对病毒感染的先天免疫中发挥作用。

规格

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16μL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：传染病、肿瘤与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64AT6PEY

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