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HTRF (H/M) ATG14 P-S29 KIT - 50K PTS

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概述

ATG14，即自噬相关蛋白 14，也被称为 BAKOR（Beclin 1 相关自噬关键调节因子），是大自噬过程中自噬体成核阶段的关键参与者。在细胞受到应激时，营养 / 能量敏感传感器 mTOR 和 AMPK 会激活 ULK1 复合体，该复合体可使 ATG14 的丝氨酸 29 位磷酸化，进而激活下游的 PIK3C3 自噬体成核复合体。

工作原理

HTRF 磷酸化 ATG14 检测原理

HTRF 磷酸化 - ATG14（Ser29）检测用于测量丝氨酸 29 位磷酸化的 ATG14。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 - ATG14（Ser29）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接相关，且在无需洗涤的检测格式中即可评估蛋白质的磷酸化状态。

HTRF 磷酸化 - ATG14 Ser29 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，最后添加磷酸化 - ATG14 Ser29 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

HTRF 磷酸化 - ATG14 Ser29 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 ATG14 Ser29 可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

使用 ULK1/2 和 mTORC1 抑制剂在人 HCT116 细胞系上对磷酸化 - ATG14（Ser29）和总蛋白试剂盒的验证

将人 HCT116 细胞接种到 96 孔培养处理板中（200,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用不同浓度的 MRT68921 处理细胞 4 小时（37°C、5% CO₂）。去除培养基后，用 25µl 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，将 14µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后依次加入 2µL 激活缓冲液和 4µL HTRF 磷酸化 - ATG14（Ser29）或总 - ATG14 检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

如预期所示，MRT68921 是一种强效的双自噬激酶 ULK1/2 抑制剂，它会抑制 ULK1 的激活，减少自噬起始机制，导致 ATG14 磷酸化呈剂量依赖性降低，而对 ATG14 总蛋白的表达水平无影响。

将人 HCT116 细胞接种到 96 孔培养处理板中（200,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用不同浓度的 AZD2014（Vistusertib）处理细胞 4 小时（37°C、5% CO₂）。去除培养基后，用 25µl 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，将 14µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后依次加入 2µL 激活缓冲液和 4µL HTRF 磷酸化 - ATG14（Ser29）或总 - ATG14 检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

如预期所示，AZD2014 是一种强效的 mTOR 抑制剂，它会解除对 ULK1 的抑制，增强自噬起始机制，导致 ATG14 的丝氨酸 29 位磷酸化增加，而对 ATG14 总蛋白的表达水平无影响。

使用 ATG14 敲除 HAP1 细胞验证 HTRF 磷酸化 - ATG14 检测的特异性

使用磷酸化（Ser29）HTRF 试剂盒在野生型（WT）和 ATG14 敲除（KO）的 HAP1 细胞中评估人源性基础磷酸化（Ser29）ATG14 的表达水平。使用 GAPDH 管家基因 HTRF 试剂盒进行归一化处理。细胞系在培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养，去除培养基后，每 1000 万个细胞用 1mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。细胞裂解后，将 14µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后依次加入 2µL 激活缓冲液和 4µL HTRF 磷酸化 - ATG14（Ser29）检测试剂。对于 GAPDH 检测，将 8µL 裂解物用 60µL 稀释剂预稀释，然后取 16µL 稀释后的样品与 4µL GAPDH 检测试剂混合。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。在 HAP1 ATG14 敲除细胞中，HTRF 信号与非特异性信号相当（未显示），这表明 ATG14 基因被完全沉默，从而证明了 HTRF 磷酸化（Ser29）ATG14 试剂盒对 ATG14 蛋白的特异性。采用 GAPDH 归一化是为了考虑亲本细胞和亲本敲除细胞之间的轻微生长差异（此处展示的是磷酸化 - ATG14 与 GAPDH 的比值）。HAP1 ATG14 敲除（1bp 缺失）细胞系来自 Horizon Discovery 公司，编号为 HZGHC024663c012；HAP1 野生型细胞来自 Horizon Discovery 公司，编号为 C631。

简化通路

大自噬中的 ATG14 信号通路

细胞自噬是一种特殊的降解和再循环过程，对细胞稳态至关重要，可由多种应激激活。自噬分为 3 种类型：大自噬、小自噬和伴侣介导的自噬。大自噬通路包括几个关键步骤：起始、成核、吞噬泡复合体延伸，然后通过 LC3-PE 募集来封存细胞质 cargo，接着与溶酶体融合实现 cargo 降解。

自噬体的生物发生由所谓的自噬相关蛋白（ATGs）通过有序且协同的作用控制，这些蛋白被激活并募集到内质网和自噬体膜上。ULK1 复合体的募集是起始步骤中的第一个事件。ULK1 是一种丝氨酸 / 苏氨酸激酶，与 Atg13、Atg101 和 FIP200 蛋白形成复合体。该复合体是核心自噬机制中最上游的组件，因此是哺乳动物细胞自噬的关键启动子。ULK1 受关键的营养 / 能量敏感激酶 mTOR 和 AMPK 调控，这两种激酶均能使 ULK1 的丝氨酸 317 位和丝氨酸 556 位磷酸化，并直接调节其激酶活性。

激活的 ULK1 复合体通过 Atg13 与 ATG14 结合，并使 ATG14 的丝氨酸 29 位磷酸化。磷酸化激活的 ATG14 的激酶活性会刺激 PIK3C3 复合体的其他蛋白（成核），该复合体负责将磷脂酰肌醇（PI）磷酸化为磷脂酰肌醇 - 3 - 磷酸（PI3P）这一关键步骤。进而促进初始吞噬体膜结构的形成，随后借助其他 ATG 蛋白（ATG16/12/5 复合体）固定 LC3-II，为延伸和闭合步骤提供支持。

这意味着 ATG14 蛋白丝氨酸 29 位的磷酸化是大自噬过程中成核阶段的关键早期标志物。

规格参数

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容裂解缓冲液：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 2、裂解缓冲液 3、裂解缓冲液 4
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
目标类别：磷酸化蛋白
目标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64ATG14S9PEY

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