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HTRF (H) ATG14 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

ATG14，即自噬相关蛋白 14，也被称为 BAKOR（Beclin 1 相关自噬关键调节因子），是大自噬过程中自噬体成核阶段的关键参与者。当细胞受到应激时，营养 / 能量敏感传感器 mTOR 和 AMPK 会激活 ULK1 复合体，该复合体可使 ATG14 的丝氨酸 29 位磷酸化，进而激活下游的 PIK3C3 自噬体成核复合体。

工作原理

总 ATG14 检测原理

总 ATG14 检测可对细胞裂解物中 ATG14 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 ATG14 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 ATG14 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用无需洗涤的格式，为评估蛋白质表达提供了便利。

总 ATG14 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至小体积检测板（HTRF 384 孔小体积板或 96 孔小体积板），再加入 HTRF 总 ATG14 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 ATG14 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 ATG14 可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

使用 ULK1/2 抑制剂在人 HCT116 细胞系上对总 ATG14 和磷酸化 ATG14（Ser29）试剂盒的验证

将人 HCT116 细胞接种到 96 孔培养处理板中（200,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用不同浓度的 MRT68921 处理细胞 4 小时（37°C、5% CO₂）。去除培养基后，用 25µl 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，将 14µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后依次加入 2µL 激活缓冲液和 4µL HTRF 总 ATG14 或磷酸化 ATG14（Ser29）检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。如预期所示，MRT68921 是一种强效的双自噬激酶 ULK1/2 抑制剂，它会抑制 ULK1 的激活，减少自噬起始机制，导致 ATG14 磷酸化呈剂量依赖性降低，而对 ATG14 总蛋白的表达水平无显著影响。

HTRF 总 ATG14 检测在人细胞系中的通用性

多种人细胞系的细胞裂解物在不同密度下培养，并在补充的 LB4 裂解缓冲液中裂解。去除培养基后，用适量体积的补充 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，将 14µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后依次加入 2µL 激活缓冲液和 4µL HTRF 总检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。如预期所示，总 ATG14 检测可检测到人源蛋白，这一点从几种人细胞系中出现的显著阳性信号可以看出。这体现了该检测的通用性。

简化通路

大自噬中的 ATG14 信号通路

细胞自噬是一种特殊的降解和再循环过程，对细胞稳态至关重要，可由多种应激激活。自噬分为 3 种类型：大自噬、小自噬和伴侣介导的自噬。大自噬通路包括几个关键步骤：起始、成核、吞噬泡复合体延伸，然后通过 LC3-PE 募集来封存细胞质 cargo，接着与溶酶体融合实现 cargo 降解。

自噬体的生物发生由所谓的自噬相关蛋白（ATGs）通过有序且协同的作用控制，这些蛋白被激活并募集到内质网和自噬体膜上。ULK1 复合体的募集是起始步骤中的第一个事件。ULK1 是一种丝氨酸 / 苏氨酸激酶，与 Atg13、Atg101 和 FIP200 蛋白形成复合体。该复合体是核心自噬机制中最上游的组件，因此是哺乳动物细胞自噬的关键启动子。ULK1 受关键的营养 / 能量敏感激酶 mTOR 和 AMPK 调控，这两种激酶均能使 ULK1 的丝氨酸 317 位和丝氨酸 556 位磷酸化，并直接调节其激酶活性。

激活的 ULK1 复合体通过 Atg13 与 ATG14 结合，并使 ATG14 的丝氨酸 29 位磷酸化。磷酸化激活的 ATG14 的激酶活性会刺激 PIK3C3 复合体的其他蛋白（成核），该复合体负责将磷脂酰肌醇（PI）磷酸化为磷脂酰肌醇 - 3 - 磷酸（PI3P）这一关键步骤。进而促进初始吞噬体膜结构的形成，随后借助其他 ATG 蛋白（ATG16/12/5 复合体）固定 LC3-II，为延伸和闭合步骤提供支持。

因此，ATG14 蛋白丝氨酸 29 位的磷酸化是大自噬过程中成核阶段的关键早期标志物。

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容裂解缓冲液：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 4
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64ATG14TPEY

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