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HTRF (H/M) ATG16L1 TOTAL KIT - 500 PTS HTRF人源/鼠源总自噬相关16样蛋白1检测试剂盒，500测试

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概述

自噬相关 16 样蛋白 1（ATG16L1）是一种自噬必需蛋白。ATG16L1 被招募到吞噬泡上，并将 ATG5-ATG12 复合物招募至吞噬泡，从而促进 LC3 脂化（LC3-I 向 LC3-II 的转化），并有助于自噬体的成熟。

丝氨酸 278（Ser278）位点磷酸化的 ATG16L1 仅存在于新形成的自噬体上，因此对其进行定量可作为自噬囊泡形成和自噬诱导的理想替代指标。ATG16L1 与阿尔茨海默病、结直肠癌、心脏病、乳腺癌和慢性粒细胞白血病等疾病相关。

工作原理

HTRF 总 ATG16L1 检测原理

HTRF 总 ATG16L1 检测可对细胞裂解物中 ATG16L1 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。HTRF 总 ATG16L1 检测使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 ATG16L1 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用无需洗涤的格式，为评估蛋白质表达提供了便利。

HTRF 总 ATG16L1 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，接着将裂解物转移到小体积检测板（HTRF 384-lv 或 96-lv 板）中，之后再加入 HTRF 总 ATG16L1 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

HTRF 总 ATG16L1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 ATG16L1 可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

使用 mTOR 和 ULK1/2 抑制剂在人 U-87 MG 细胞系上对 HTRF 总 ATG16L1 和磷酸化 ATG16L1（Ser278）试剂盒的验证

将人 U-87 MG 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。然后用不同浓度的 mTOR 抑制剂 AZD2014 处理细胞，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 3 小时。移除培养基后，加入 25 µL 补充的 3 号裂解缓冲液（1X）+ BR（2X），在室温下轻轻振荡裂解细胞 1 小时。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）或总 ATG16L1 检测试剂。在室温下孵育过夜后，记录两个试剂盒的 HTRF 信号。正如预期的那样，强效 mTOR 抑制剂 AZD2014 可诱导自噬激活，导致 ATG16L1 的 Ser278 位点磷酸化水平呈剂量依赖性增加，而对总 ATG16L1 蛋白的表达水平无显著影响。

使用 mTOR 和 ULK1/2 抑制剂在人 U-87 MG 细胞系上对 HTRF 总 ATG16L1 和磷酸化 ATG16L1（Ser278）试剂盒的验证：将人 U-87 MG 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用 2.5 µM 的 mTOR 抑制剂 AZD2014 和不同浓度的自噬激酶 ULK1/2 抑制剂 ULK-101 处理细胞，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 3 小时。移除培养基后，加入 25 µL 补充的 3 号裂解缓冲液（1X）+ BR（2X），在室温下轻轻振荡裂解细胞 1 小时。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）或总 ATG16L1 检测试剂。在室温下孵育过夜后，记录两个试剂盒的 HTRF 信号。正如预期的那样，强效双重自噬激酶 ULK1/2 抑制剂 ULK-101 可抑制 AZD2014 诱导的自噬激活，导致 ATG16L1 的 Ser278 位点磷酸化水平呈剂量依赖性降低，而对总 ATG16L1 蛋白的表达水平无显著影响。

使用 HAP1 ATG16 敲除细胞验证 HTRF 总 ATG16 检测的特异性

使用 HTRF 总试剂盒在野生型（WT）和 ATG16 敲除（KO）的 HAP1 细胞中评估人总 ATG16L1 的表达水平。将细胞系在培养瓶中培养，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 48 小时。移除培养基后，加入补充的 3 号裂解缓冲液（1X）+ BR（2X），在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 ATG16L1 检测试剂。同时，使用 GAPDH 管家细胞试剂盒（# 64GAPDHPET/G/H）监测 GAPDH 水平：将 4 µL 细胞裂解物用 180 µL 11 号稀释剂预稀释，然后将 16 µL 该稀释液与 4 µL HTRF GAPDH 管家细胞检测试剂混合。在室温下孵育过夜后，记录两个试剂盒的 HTRF 信号。在两种测试条件下，测得的 GAPDH 水平相当。相比之下，HAP1 WT 细胞中 HTRF 总 ATG16L1 信号显著为阳性，而 HAP1 ATG16 KO 细胞中该信号显著降低（与阴性信号相当），这证明了 HTRF 总 ATG16L1 检测对 ATG16L1 蛋白检测的特异性。

HAP1 ATG16 KO（10bp 缺失）细胞系购自 Horizon Discovery，货号# HZGHC000296c010；HAP1 WT 细胞系购自 Horizon Discovery，货号# C631。

HTRF 总 ATG16L1 检测在多种物种细胞系中的通用性

将人（PC-3）、小鼠（C2C12）和大鼠（H4-II-E）细胞系以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔板中。孵育 24 小时后，加入 25 µL 补充的 3 号裂解缓冲液（1X）+ BR（2X），在室温下轻轻振荡裂解细胞 1 小时。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 ATG16L1 检测试剂。在室温下孵育过夜后，记录 HTRF 信号。HTRF 总 ATG16L1 检测在测试的 3 个物种的细胞系中均能有效显示显著的阳性信号，这表明它能够检测人、小鼠和大鼠版本的该蛋白，适用于转化研究。

HTRF 总 ATG16L1 检测试剂盒与蛋白质印迹法的比较

将 HCT116 细胞在培养瓶中培养，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 48 小时。然后用 100 nM 的花萼海绵诱癌素 A（Calyculin A）处理细胞 10 分钟。移除培养基后，加入补充的 3 号裂解缓冲液（1X）+ BR（2X），在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。取等量的裂解物进行蛋白质印迹法（WB）和 HTRF 检测的平行比较。结果显示，HTRF 总 ATG16L1 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

简化通路

大自噬中简化的 ATG16 信号通路

自噬是一种进化上保守的细胞过程，几乎存在于所有真核细胞中，从酵母到哺乳动物均有发生。自噬在维持体内平衡方面至关重要，参与众多生理过程，包括应激反应（如饥饿、缺氧、高温）、细胞生长和衰老。相反，自噬机制的功能障碍与癌症、神经退行性疾病、传染病以及心脏和代谢疾病等相关。自噬分为 3 种类型：大自噬、小自噬和伴侣介导的自噬。大自噬（以下简称自噬）始于富含磷脂酰肌醇 3 - 磷酸的膜（如内质网、高尔基体或质膜）上芽体的形成，这种结构被称为自噬前体结构（PAS）。这种杯状结构需要由 Atg13、Atg101、FIP200 和 ULK1 蛋白形成的 ULK1/Atg1 复合物。囊泡中含有的跨膜蛋白 Atg9 参与将 Atg2-Atg18 招募到 PAS。Atg2 蛋白具有磷脂转移活性，可为膜延伸提供必要的磷脂。ULK1 磷酸化并激活 Beclin1，Beclin1 与 Vsp15、Vsp34、Atg14 和 NRFB2/Atg38 结合，形成 III 类磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3KC3 - 复合物 1）。该复合物可促进磷酸肌醇三磷酸（PIP3）的产生，进而引导 PI3P 结合的 Atg18/WIPI 1-4 蛋白和 Atg12-Atg5-Atg16 复合物的招募。后者与 Atg4 和 Atg7 一起参与吞噬泡上的 LC3B 脂化（LC3-I 向 LC3-II 的转化），这有助于自噬体的成熟，随后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，其中捕获的细胞成分被降解，其构建模块被回收利用。

丝氨酸 278 位点磷酸化的 ATG16L1 仅存在于新形成的自噬体上，因此对其进行定量可作为自噬囊泡形成和自噬诱导的理想替代指标。重要的是，其水平不受长期应激或晚期自噬阻断的影响，而这些因素可能会干扰自噬分析。此外，自噬激酶 ULK1 对 ATG16L1 的磷酸化是自噬诱导的保守指标，多种刺激均可激活该过程。综上所述，对 ATG16L1 磷酸化的分析是研究自噬诱导的优良检测指标。

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64ATG16TPEG

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参考价格 ¥ 28096.14

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