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HTRF (H) AUR A P-T288 KIT - 10K PTS

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概述

这种基于 HTRF 的细胞检测方法可便捷、准确地检测在真核生物中广泛表达的人源 Aurora A 蛋白（与 AURKA 基因相关）。Aurora A 属于丝氨酸 / 苏氨酸 Aurora 激酶家族（包括 Aurora B 和 Aurora C），通过调控有丝分裂（尤其是染色体分离过程）在细胞分裂中发挥关键作用。它通过苏氨酸 288（Thr288）残基的自磷酸化被激活，该过程主要发生在细胞分裂周期的 S 期晚期至 M 期，或 DNA 损伤应答过程中。Aurora 激酶在多种癌症（白血病、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌）中存在过表达，这使其成为 Aurora 激酶抑制剂（AKIs）研发的重要靶点。

工作原理

磷酸化 Aurora A（Thr288）检测原理

磷酸化 Aurora A（Thr288）检测用于测量 Thr288 位点磷酸化的 Aurora A。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 Aurora A（Thr288）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用免洗涤格式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了便利。

phospho-how-it-works-phospho-btk-tyr223-a1.svg（示意图）

磷酸化 Aurora A（Thr288）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，最后加入磷酸化 Aurora A（Thr288）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

HTRF 总 BRD2 检测的双板方案

磷酸化 Aurora A（Thr288）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 Aurora A（Thr288）可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

HTRF 总 BRD2 检测的单板方案

检测验证

在 HeLa 细胞中检测总 Aurora A 和磷酸化 Aurora A（Thr288）的激活情况

将 HeLa 细胞（永生化人宫颈癌细胞系）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，在完全培养基中培养 24 小时以使其贴壁。移除细胞培养基后，用浓度递增的诺考达唑在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 20 小时。过夜处理（20 小时）后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50µl 补充的 1X 裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡 30 分钟。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF 总 Aurora A 或磷酸化 Aurora A（Thr288）检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。诺考达唑是一种微管去稳定剂，可诱导 G2/M 期细胞周期停滞。有研究表明，经诺考达唑处理的细胞会通过提高 Aurora 蛋白表达水平来克服细胞周期停滞 [1]。正如预期，结果显示经诺考达唑处理后，总 Aurora A 蛋白和 Thr288 磷酸化 Aurora A 蛋白的水平均有所增加。

[1]：Jiang 等人，《癌基因》，2003 年

1assay-validation-aurora-a-phospho-pharmaco-1.svg（验证示意图 1）

在 HeLa 细胞中利用磷酸化 Aurora A（Thr288）和总 Aurora A 对抑制剂进行表征

2assay-validation-aurora-a-phospho-pharmaco-2-1.svg（验证示意图 2-1）
3assay-validation-aurora-a-phospho-pharmaco-2-2.svg（验证示意图 2-2）

将 HeLa 细胞（永生化人宫颈癌细胞系）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，在完全培养基中培养 24 小时以使其贴壁。移除细胞培养基后，用浓度递增的抑制剂（MLN8054、托沙替尼、阿利塞替尼）与 200nM 的固定浓度诺考达唑共同孵育，在含 5% 胎牛血清的细胞培养基中于 37°C、5% CO₂条件下处理 20 小时。过夜处理后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50µl 补充的 1X 裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡 30 分钟。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF 总 Aurora A 或磷酸化 Aurora A（Thr288）检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

文献中已证实这 3 种化合物对磷酸化 Aurora A（Thr288）具有抑制作用，最大抑制率可达 98%，且不影响总蛋白水平 [2,3,4,5]。

正如预期，结果显示经 MLN8054、托沙替尼或阿利塞替尼处理后，Aurora A 在 Thr288 位点的磷酸化水平呈明显的剂量依赖性降低，而 Aurora A 蛋白的表达水平保持不变。

[2]：Manfredi 等人，《美国国家科学院院刊》，2006 年
[3]：Sells 等人，《ACS 药物化学快报》，2015 年
[4]：Tyler 等人，《细胞周期》，2007 年
[5]：Qi 等人，《白血病研究》，2013 年

4assay-validation-aurora-a-phospho-pharmaco-3.svg（验证示意图 3）

磷酸化 Aurora A 抑制剂与磷酸化 Aurora B 抑制剂的谱效分析

5assay-validation-aurora-a-phospho-pharmaco-4-1.svg（验证示意图 4-1）
6assay-validation-aurora-a-phospho-pharmaco-4-2.svg（验证示意图 4-2）

将 HeLa 细胞（永生化人宫颈癌细胞系）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，在完全培养基中培养 24 小时以使其贴壁。移除细胞培养基后，用浓度递增的抑制剂（MLN8054、托沙替尼、阿利塞替尼）与 200nM 的固定浓度诺考达唑共同孵育，在含 5% 胎牛血清的细胞培养基中于 37°C、5% CO₂条件下处理 20 小时。过夜处理后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50µl 补充的 1X 裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡 30 分钟。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF 总 Aurora A（#64AURATPEG/H）、磷酸化 Aurora A（Thr288）、总 Aurora B（#64AURBTPEG/H）或磷酸化 Aurora B（Thr232）（#64AURBT2PEG/H）检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

结果显示，抑制剂浓度越高，磷酸化水平降低越明显，且具有预期的选择性 [2,3,4,5]：

托沙替尼是一种 Aurora A 和 Aurora B 泛抑制剂。
阿利塞替尼对 Aurora A 的选择性是对 Aurora B 的 20 倍。
MLN8054 是一种高选择性 Aurora A 抑制剂（至少在 1µM 浓度下不会抑制 Aurora B Thr232 的磷酸化）。

Aurora A 和 Aurora B 蛋白的表达水平保持不变（数据未显示）。

7assay-validation-aurora-a-phospho-pharmaco-5.svg（验证示意图 5）

利用基因沉默（SiRNA）验证 HTRF 磷酸化 Aurora A 检测的特异性和选择性

在 96 孔板中（25,000 个细胞 / 孔），用 25nM 的 SMARTPool ON-TARGETplus siRNA（Horizon）分别特异性靶向 Aurora A（#L-003545-01-0005）、Aurora B（#L-003326-00-0005）和 Aurora C（#L-019573-00-0005）处理 HeLa 细胞，或用非靶向 siRNA（#D-001810-10-20，作为对照）处理，在 100µL 体系中培养 24 小时。移除细胞培养基后，在完全细胞培养基中加入 300nM 诺考达唑刺激细胞，在 37°C、5% CO₂条件下再孵育 24 小时。移除培养基后，用 50µL 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL 预混合的 HTRF 磷酸化 Aurora A（Thr288）检测抗体。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。用 Aurora A siRNA 处理细胞后，Aurora A 显著下调，与转染非靶向 siRNA 的细胞相比，信号降低了 57%。

尽管这 3 种家族蛋白同源性较高，但用 Aurora B 或 Aurora C siRNA 处理的细胞未出现信号降低，这证明了该试剂盒的特异性和选择性。

8assay-validation-aurora-a-phospho-pharmaco-6.svg（验证示意图 6）

在多种人细胞系上的验证

将永生化人细胞系 HepG2（肝癌）、HeLa（宫颈癌）、HEK293 和 HCT116（结肠癌）以 25,000 或 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。移除细胞培养基后，在完全细胞培养基中加入 300nM 诺考达唑，在 37°C、5% CO₂条件下刺激 20 小时。移除培养基后，用 50µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。

使用 HTRF 磷酸化 Aurora A（Thr288）试剂盒评估磷酸化 Aurora A 蛋白的表达水平。简要步骤为：将 16µL 细胞裂解物转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL 预混合的 HTRF 检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在所有测试的人细胞系中，均能检测到不同水平的磷酸化 Aurora A（Thr288）蛋白。对于特定的细胞模型，必须优化细胞密度以使其处于试剂盒的动态范围内。值得注意的是，HepG2 细胞中 Aurora A 蛋白表达水平较高，因此与 HeLa、HEK293 或 HCT116 细胞（25,000 至 100,000 个细胞 / 孔）相比，HepG2 细胞需使用更低的密度（25,000 个细胞 / 孔或更低）才能处于动态范围内。

HTRF 磷酸化 Aurora A（Thr288）检测能有效检测多种表达不同水平该蛋白的人细胞模型中的内源性磷酸化 Aurora A 蛋白。

9assay-validation-aurora-a-phospho-pharmaco-7.svg（验证示意图 7）

HTRF 磷酸化 Aurora A（Thr288）检测与蛋白质印迹法的比较

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 24 小时后，先用 300nM 诺考达唑在 37°C、5% CO₂条件下刺激 20 小时，然后用 3mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL 磷酸化 Aurora A（Thr288）检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍。

10assay-validation-aurora-a-phospho-pharmaco-8.png（验证示意图 8）

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人类
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64AURAT2PEH

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