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HTRF BAD P-S112 KIT - 500 PTS

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概述

磷酸化 Bad（Ser112）细胞试剂盒旨在简化并高效定量细胞裂解物中的磷酸化 BAD 蛋白。这种快速便捷的免洗涤方案可提供高灵敏度结果，适用于药物研发的各个阶段，从基础研究到高通量筛选。

工作原理

磷酸化 BAD（Ser112）检测原理

磷酸化 BAD（Ser112）检测用于测量在 Ser112 位点发生磷酸化的 BAD 蛋白。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 BAD（Ser112）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用免洗涤格式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了便利。

1phospho-how-it-works-phospho-stat6-y641-assay-principle.svg（磷酸化 BAD（Ser112）检测原理示意图）

磷酸化 BAD（Ser112）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，最后加入磷酸化 BAD（Ser112）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

Two-plate protocol of the HTRF total BRD2 assay（HTRF 总 BRD2 检测的双板方案示意图）

磷酸化 BAD（Ser112）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 BAD（Ser112）可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

One-plate protocol of the HTRF total BRD2 assay（HTRF 总 BRD2 检测的单板方案示意图）

检测验证

磷酸化 BAD（Ser112）试剂盒的蛋白质印迹法与 HTRF 检测比较

将 Cos-7 细胞在 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养 1 天。第 2 天：移除细胞培养基后，加入 3mL 补充的裂解缓冲液，孵育 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。使用等量的裂解物进行蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较。HTRF 磷酸化 Bad（Ser112）检测可检测到 220 个细胞，而蛋白质印迹法需要 1750 个细胞。HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

1assay-validation-bad-phospho-s112-1.png（相关结果图）

磷酸化 BAD（Ser112）试剂盒在 HEK293 细胞上的 PMA 剂量反应

将人 HEK293 细胞（100,000 个细胞 / 孔）用不同浓度的 PMA 在 37°C 条件下刺激 30 分钟。裂解孵育 30 分钟后，使用双板检测方案测量磷酸化 Bad。

2assay-validation-bad-phospho-s112-2.svg（相关结果图）

星形孢菌素对受刺激的 MCF7 和 Cos-7 细胞的抑制作用

将人 MCF7 细胞和猴 Cos-7 细胞（25,000 个细胞 / 孔）与不同浓度的星形孢菌素抑制剂在 37°C 条件下孵育 3 小时。然后加入 0.8µM 的 PMA 刺激细胞，样品孵育 30 分钟。裂解孵育 30 分钟后，使用双板方案的 HTRF 磷酸化 Bad（Ser112）检测测量 Bad 磷酸化的抑制情况。

3assay-validation-bad-phospho-s112-3.svg（相关结果图）

简化通路

促凋亡因子 Bad 信号的简化通路
Bad 是一种促凋亡因子，属于 Bcl-2 蛋白家族，通过调控细胞色素 C 的释放来控制线粒体膜的通透性。在健康的增殖细胞中，Bad 被磷酸化并隔离在细胞质中；而在应激细胞中，死亡刺激会诱导 Bad 去磷酸化并转移到线粒体膜上，通过与 Bcl-Xl 或 Bcl-2 异源二聚化使其失活，从而诱导细胞色素 C 释放，导致细胞凋亡。

4phospho-pathway-pro-apoptotic-factor-bad-64badpeg-64badpeh-64badpet-64badpey.svg（相关通路图）

规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：3 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64BADPEG

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