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HTRF 4EBP1 P-T37/46 KIT - 500 PTS 磷酸化4EBP1检测试剂盒 - 500测试

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述概

磷酸化 4EBP1 检测试剂盒旨在定量内源性在苏氨酸 37/46（Thr37/46）位点发生磷酸化的 4EBP1 蛋白。基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）技术，HTRF 磷酸化 4EBP1 夹心免疫检测为任何细胞类型中的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号传导和翻译控制通路提供了理想的读数解决方案。优化后的免洗涤方案操作更便捷，能提供更具相关性和可靠性的结果，为信号通路机制研究、化合物作用机制分析及靶点研究提供了便利。

工作原理

磷酸化 4EBP1（Thr37/46）检测原理

磷酸化 4EBP1（Thr37/46）检测用于测量在 Thr37/46 位点发生磷酸化的 4EBP1 蛋白。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 4EBP1（Thr37/46）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用免洗涤格式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了便利。

phospho-cellular-kit-1.svg（磷酸化 4EBP1 检测原理示意图）

磷酸化 4EBP1（Thr37/46）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，最后加入磷酸化 4EBP1（Thr37/46）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

phospho-cellular-kit-2.svg（磷酸化 4EBP1 双板检测方案示意图）

磷酸化 4EBP1（Thr37/46）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 4EBP1（Thr37/46）可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

phospho-cellular-kit-3.svg（磷酸化 4EBP1 单板检测方案示意图）

检测验证

磷酸化 4EBP1 HTRF 检测与蛋白质印迹法的性能比较

将人 HEK293 细胞在 T175 培养瓶中于 37°C 条件下培养至 80% 汇合度。移除细胞培养基后，加入 3mL 补充的裂解缓冲液，孵育 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。使用等量的裂解物进行蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较。使用 HTRF 磷酸化 4EBP1（Thr37/46）检测，仅需 400 个细胞即可实现最小信号检测，而蛋白质印迹法需要 11,300 个细胞才能产生信号。HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 32 倍。

phospho-cellular-kit-4.png（相关结果图）

mTORC1 激活后的磷酸化 4EBP1 反应

将 Jurkat、A431 和 SW480 细胞以 25,000 个细胞 / 孔的密度接种到含 DMEM+10% 胎牛血清的 96 孔板中，培养 24 小时。用已知的泛 mTOR 抑制剂处理细胞 3 小时，所用抑制剂为浓度递增的 PP242 或 BEZ235。A431 和 SW480 细胞采用双板贴壁方案，Jurkat 细胞则采用双板悬浮方案。

phospho-cellular-kit-5.svg、phospho-cellular-kit-6.svg（相关结果图）

物种兼容性：小鼠 NIH3T3 细胞中的 PP242 + 雷帕霉素

将小鼠 NIH3T3 细胞与不同浓度的 PP242 和雷帕霉素共同孵育，然后用胰岛素在 37°C 条件下刺激 30 分钟。裂解后，根据双板方案，使用 HTRF 磷酸化 4EBP1（Thr37/46）检测测量 4EBP1 磷酸化的抑制情况。PP242 是一种强效的泛 mTOR 抑制剂，可抑制 mTORC1（包括雷帕霉素耐药的 4EBP 磷酸化）和 mTORC2，而已知雷帕霉素处理对 4EBP1 磷酸化仅具有部分作用或无作用。

phospho-cellular-kit-7.svg（相关结果图）

简化通路

当核糖体被招募到 mRNA 的 5' 端时，翻译启动。eIF4E 结合蛋白（如 4EBP1）通过与 eIF4E 结合并阻止翻译机制的招募来抑制翻译。低磷酸化的 4EBP1 会下调翻译，而 mTOR 介导的 4EBP1 高磷酸化会消除其与 eIF4E 的结合活性，从而促进翻译。细胞内磷酸化 4EBP1 的评估是衡量 mTOR 效力和确定 mTOR 信号传导活性的重要工具。

phospho-cellular-kit-8.svg（相关通路图）

规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：代谢 / 糖尿病
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64BP1PEG

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