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HTRF (H) CDK12 TOTAL KIT - 500 PTS 全周期蛋白依赖激酶12检测试剂盒-500测试

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概述

总 CDK12 细胞检测可监测 CDK12 蛋白水平。

CDK12 是一种与转录相关的细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）。它与细胞周期蛋白 K 形成复合物，通过磷酸化 RNA 聚合酶 II（RNAP II）调控基因转录延伸，同时也参与翻译调控。此外，CDK12 在 RNA 剪接、细胞周期进程、细胞增殖、DNA 损伤应答（DDR）以及基因组稳定性维持中发挥作用。由于 CDK12 的突变或扩增与肿瘤发生密切相关，因此 CDK12 已成为癌症治疗中一个极具吸引力的治疗靶点。

工作原理

总 CDK12 检测原理

总 CDK12 检测可对细胞裂解物中 CDK12 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 CDK12 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 CDK12 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中该蛋白的浓度直接成正比，并在免洗涤的检测格式下为评估蛋白的表达水平提供了手段。

HTRF 总 CDK12 检测原理

总 CDK12 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，之后加入总 CDK12 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

HTRF 总 CDK12 双板检测方案

总 CDK12 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 CDK12 可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中完成。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

HTRF 总 CDK12 单板检测方案

检测验证

通过 siRNA 实验验证总 CDK12 检测的特异性

将 HeLa 细胞接种到 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔），培养 24 小时。然后用针对 CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDK7、CDK9 或 CDK12 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，随后加入 4µL HTRF 总 CDK12 检测抗体。另外，将 4µL 裂解物（补充 12µL 稀释剂 #11）也转移到微孔板中，使用 GAPDH 管家细胞试剂盒（64GAPDHPET/G/H）监测 GAPDH 水平。过夜孵育后记录两个试剂盒的 HTRF 信号。

与转染阴性 siRNA 的细胞相比，转染 CDK12 siRNA 的细胞信号降低了 90%。转染 CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDK7 或 CDK9 siRNA 的细胞未观察到信号降低。在所有测试条件下，测得的 GAPDH 水平保持不变。数据表明，HTRF 总 CDK12 检测对 CDK12 蛋白的检测具有特异性，且不会与其他 CDK 家族成员发生交叉反应。

总 CDK12 检测的 siRNA 实验

多种细胞系中总 CDK12 水平的评估

将多种细胞系（贴壁的 HeLa、HEK293、SHSY5Y 细胞或悬浮细胞如 K562 细胞）以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用补充的裂解缓冲液裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 CDK12 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

人细胞系中总 CDK12 检测的验证

使用 CDK12 PROTAC 降解总 CDK12

将 HeLa 细胞以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 6 小时。然后用溶媒（DMSO）、CDK12 PROTAC（BSJ-4-116）、CDK12 结合剂（THZ531）、CRBN 结合剂（沙利度胺）或 100nM 的无关 PROTAC 在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 16 小时。用 50µL 补充的 2 号裂解缓冲液裂解细胞后，将相同的裂解物依次分配到小体积白色检测板中：16µL 用于总 CDK12 检测，另外 4µL（补充 12µL 稀释剂 #11）用于使用 HTRF GAPDH 管家试剂盒（64GAPDHPET/G/H）检测 GAPDH 水平。加入 4µL 相应的试剂盒检测试剂，过夜孵育后记录 HTRF 信号。与溶媒（DMSO）处理的细胞相比，CDK12 PROTAC（BSJ-4-116）诱导 CDK12 蛋白降解，信号降低了 82%。用 CDK12 结合剂、CRBN 结合剂或无关 PROTAC 处理的细胞未观察到信号降低。在所有测试条件下，测得的 GAPDH 水平保持不变（无细胞毒性）。

使用 PROTAC 化合物对总 CDK12 检测的验证

HeLa 和 K562 细胞中总 CDK12 的降解

将 HeLa 和 K562 细胞以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 6 小时。然后用浓度递增的 CDK12 PROTAC（BSJ-4-116）在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 16 小时。细胞裂解后，将相同的裂解物依次分配到小体积白色检测板中：16µL 用于总 CDK12 检测，另外 4µL（补充 12µL 稀释剂 #11）用于使用 HTRF GAPDH 管家试剂盒（64GAPDHPET/G/H）检测 GAPDH 水平。加入 4µL 相应的试剂盒检测试剂，过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，结果显示用 CDK12 PROTAC 处理后，HeLa 和 K562 细胞中的总 CDK12 呈剂量依赖性降解（半数最大降解浓度分别为 40nM 和 58nM），而 GAPDH 水平保持恒定。

使用 CDK12 PROTAC 对总 CDK9 降解检测的验证

HTRF 总 CDK12 检测与蛋白质印迹法的比较

将 K562 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，用 3mL 补充的 2 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 CDK12 检测试剂。使用等量的裂解物对 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行比较。

使用 HTRF 总 CDK12 检测时，1200 个细胞 / 孔就足以检测到显著信号，而使用带有 ECL 检测的蛋白质印迹法则需要 3600 个细胞。因此，在这些条件下，HTRF 总 CDK12 检测的灵敏度是蛋白质印迹技术的 3 倍。

总 CDK12 检测中 HTRF 与 WB 的灵敏度比较

简化通路

CDK12 在细胞分裂周期中的作用

CDK 传统上分为两个亚家族成员：协调细胞周期进程的 CDK（CDK1、CDK2、CDK4 和 CDK6）和转录 CDK（CDK7、CDK8、CDK9、CDK12 和 CDK13）。

CDK12（细胞周期蛋白依赖性激酶 12）与细胞周期蛋白 K 形成复合物，调控 RNA 聚合酶 II 的 C 末端结构域（CTD）的磷酸化。CDK12 调控参与 DNA 修复的基因表达，是维持基因组稳定性所必需的。

CDK12 通路

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
兼容自动化：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：2 号裂解缓冲液
分子修饰：总量
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64CDK12TPEG

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