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HTRF (H/M) CDK1 P-T14 KIT - 50K PTS

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概述

这种基于 HTRF 细胞的检测方法可便捷、准确地检测 Thr14 位点磷酸化的 CDK1。

CDK1（细胞周期蛋白依赖性激酶 1）是协调哺乳动物细胞周期进程的 CDK 亚家族成员之一（该亚家族还包括 CDK1、CDK4 和 CDK6）。CDK1 是一种名为 M 期促进因子的蛋白激酶的催化亚基，可诱导细胞进入有丝分裂期。CDK1 通过与多种间期细胞周期蛋白（细胞周期蛋白 A、细胞周期蛋白 B）结合，促进 G2 期到 M 期的转换，并调控 G1 期进程和 G1 期到 S 期的转换。Wee1 和 Myt1 蛋白激酶可使 CDK1 的 Thr14 和 Tyr15 位点发生磷酸化，从而抑制 CDK1 的活性。cdc25 磷酸酶可能负责去除 Thr14 和 Tyr15 位点的磷酸基团，进而激活 CDK1。

Thr14 位点的 CDK1 抑制性磷酸化对于维持基因组完整性以及在 S 期防止 DNA 损伤至关重要。因此，Wee1/cdc25A 轴是癌症治疗中一个极具吸引力的靶点，或许代表了一种使具有过度活跃 CDK1 的癌细胞致敏的独特方法。

工作原理

磷酸化 CDK1（Thr14）检测原理

磷酸化 CDK1（Thr14）检测用于测量 Thr14 位点磷酸化的 CDK1。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。该检测使用两种抗体，一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质磷酸化状态的方法。

磷酸化 CDK1（Thr14）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 CDK1（Thr14）的 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 CDK1（Thr14）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 CDK1（Thr14）可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

使用羟基脲调节磷酸化 CDK1（Thr14）

将 HeLa 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）培养 6 小时，然后用浓度递增的羟基脲（单链断裂诱导剂）处理过夜。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）或总 CDK1 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期，羟基脲引发 Thr14 位点磷酸化的 CDK1 呈剂量依赖性增加，而该蛋白质的表达水平未受此处理的调节。

使用 Wee1/Myt1 抑制剂调节磷酸化 CDK1（Thr14）

将 HeLa 和 MCF7 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）培养 24 小时，然后用 Wee1/Myt1 激酶抑制剂 PD0166285 处理 2 小时。

细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）或总 CDK1 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期，Wee1/Myt1 激酶抑制剂 PD166285 降低了 Thr14 位点磷酸化的 CDK1，而该蛋白质的表达水平保持稳定。

通过 siRNA 敲低实验验证磷酸化 CDK1（Thr14）检测的特异性

将 HeLa 细胞接种到 96 孔板中（10,000 个细胞 / 孔），培养 24 小时。然后用针对 CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5 或 CDK6 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后，裂解细胞。将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

与转染阴性 siRNA 的细胞相比，转染 CDK1 siRNA 的细胞信号降低 72%。相反，敲低 CDK2、CDK3、CDK4、CDK5 或 CDK6 并未导致任何信号降低，这表明 HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）检测对 CDK1 的磷酸化具有特异性，且不会与其他细胞周期 CDK 家族成员发生交叉反应。

多种细胞系中磷酸化 CDK1（Thr14）水平的评估

将贴壁的人源和鼠源细胞（HeLa、MCF7 和 Neuro 2A）或悬浮细胞（如 THP1 细胞）以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用补充的裂解缓冲液裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）检测能有效检测多种表达不同水平该蛋白的细胞模型中的磷酸化 CDK1（Thr14）。

HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）检测与蛋白质印迹法的比较

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，用 3mL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）检测时，625 个细胞 / 孔就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法获得最小化学发光信号则需要 20,000 个细胞。因此，在此条件下，HTRF 磷酸化 CDK1（Thr14）检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 32 倍。

简化通路

磷酸化 CDK1 在细胞分裂周期中的作用
CDK1（细胞周期蛋白依赖性激酶 1）是协调哺乳动物细胞周期进程的 CDK 亚家族成员之一（该亚家族还包括 CDK2、CDK4 和 CDK6）。

有丝分裂原信号（如生长因子）通过诱导细胞周期蛋白 D 的合成，触发细胞进入细胞周期的 G1 期，进而形成有活性的 CDK4/6 - 细胞周期蛋白 D 复合物。CDK4 和 CDK6 使视网膜母细胞瘤（RB）蛋白发生单磷酸化，此时 RB 仍与转录因子 E2F 结合，但部分基因（如细胞周期蛋白 E）可被转录。在 G1 期晚期和 S 期早期，细胞周期蛋白 E 与 CDK2 相互作用并激活 CDK2，CDK2 进而磷酸化 RB 上的其他位点，导致其完全失活。因此，S 期进程所需的 E2F 应答基因被诱导表达，例如细胞周期蛋白 A，它随后与 CDK2 相互作用形成细胞周期蛋白 A/CDK2 复合物。被激活的 CDK2 最终磷酸化 Cdc25B 和 Cdc25C 磷酸酶，这些磷酸酶进而激活 CDK1，而 CDK1 是细胞分裂周期中 G2 期和 M 期进程（中心体成熟与分离、染色体凝缩以及核膜破裂后的有丝分裂进入）所必需的。

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64CDK1T4PEY

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