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HTRF (H) CDK1 TOTAL KIT - 500 PTS 全周期蛋白依赖激酶1检测试剂盒-500测试

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品牌： Revvity

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概述

CDK1，也称为细胞分裂周期蛋白 2（Cdc2），是一种在真核生物中广泛表达的丝氨酸 / 苏氨酸激酶。CDK1 是一种名为 M 期促进因子的蛋白激酶的催化亚基，该因子可诱导细胞进入有丝分裂期。CDK1 通过与多种间期细胞周期蛋白（周期蛋白 A、周期蛋白 B）结合，促进 G2 期到 M 期的转换，并调控 G1 期进程及 G1 期到 S 期的转换。CDK1 的激活失调会导致细胞分裂失控，这是癌症的一个标志。因此，对 CDK1 的抑制是一个活跃的研究领域，尤其是随着蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）等新方法的出现。

工作原理

总 CDK1 检测原理

总 CDK1 检测可对细胞裂解物中 CDK1 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 CDK1 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 CDK1 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中该蛋白的浓度直接成正比，并在免洗涤的检测格式下为评估蛋白的表达水平提供了手段。

human-total-CDK1-detection-kit（人源总 CDK1 检测试剂盒）

总 CDK1 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，之后加入总 CDK1 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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总 CDK1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 CDK1 可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中完成。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

通过 siRNA 实验验证总 CDK1 检测的特异性

将 HeLa 细胞接种到 96 孔板中（10,000 个细胞 / 孔），培养 24 小时。然后用针对 CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDK7、CDK9 或 CDK12 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，随后加入 4µL HTRF 总 CDK1 检测抗体。另外，将 4µL 裂解物（补充 12µL 稀释剂 #11）也转移到微孔板中，使用 GAPDH 管家细胞试剂盒（64GAPDHPET/G/H）监测 GAPDH 水平。过夜孵育后记录两个试剂盒的 HTRF 信号。

与转染阴性 siRNA 的细胞相比，转染 CDK1 siRNA 的细胞信号降低了 81%。转染 CDK2、CDK4、CDK6、CDK7、CDK9 或 CDK12 siRNA 的细胞未观察到信号降低。在所有测试条件下，测得的 GAPDH 水平保持不变。数据表明，HTRF 总 CDK1 检测对 CDK1 蛋白的检测具有特异性，且不会与其他 CDK 家族成员发生交叉反应。

human-total-CDK1-detection-kit（人源总 CDK1 检测试剂盒）

human-total-CDK1-detection-kit（人源总 CDK1 检测试剂盒）

人细胞系中总 CDK1 水平的评估

将多种人细胞系（贴壁的 HeLa、MCF7、SHSY5Y 细胞或悬浮细胞如 K562 细胞）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用补充的裂解缓冲液裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 CDK1 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

human-total-CDK1-detection-kit（人源总 CDK1 检测试剂盒）

HTRF 总 CDK1 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，用 3mL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 CDK1 检测试剂。使用等量的裂解物对 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行比较。

使用 HTRF 总 CDK1 检测时，1250 个细胞 / 孔就足以检测到显著信号，而使用带有 ECL 检测的蛋白质印迹法则需要 10,000 个细胞。因此，在这些条件下，HTRF 总 CDK1 检测的灵敏度是蛋白质印迹技术的 8 倍。

human-total-CDK1-detection-kit（人源总 CDK1 检测试剂盒）

简化通路

CDK1 在细胞分裂周期中的作用

CDK1（细胞周期蛋白依赖性激酶 1）是协调哺乳动物细胞周期进程的 CDK 亚家族成员（该亚家族还包括 CDK2、CDK4 和 CDK6）。

有丝分裂原信号（如生长因子）通过诱导周期蛋白 D 的合成，触发细胞进入细胞周期的 G1 期，进而形成有活性的 CDK4/6 - 周期蛋白 D 复合物。CDK4 和 CDK6 使视网膜母细胞瘤（RB）蛋白发生单磷酸化，此时 RB 仍与转录因子 E2F 结合，但部分基因可被转录，如周期蛋白 E。在 G1 期晚期和 S 期早期，周期蛋白 E 与 CDK2 相互作用并激活 CDK2，CDK2 进而磷酸化 RB 上的其他位点，导致其完全失活。因此，S 期进程所需的 E2F 应答基因被诱导表达，如周期蛋白 A，随后周期蛋白 A 与 CDK2 相互作用形成周期蛋白 A/CDK2 复合物。激活的 CDK2 最终磷酸化 Cdc25B 和 Cdc25C 磷酸酶，这些磷酸酶进而激活 CDK1，而 CDK1 是细胞分裂周期中 G2 期和 M 期进程（中心体成熟与分离、染色体凝缩以及核膜破裂后的有丝分裂进入）所必需的。

human-total-CDK1-detection-kit（人源总 CDK1 检测试剂盒）

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
兼容自动化：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总量
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64CDK1TPEG

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