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HTRF (H/M) CDK5 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

CDK5 属于细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdks）家族。尽管与 Cdks 家族的其他成员具有高度的序列同源性，但 CDK5 是一个特殊的成员，因为它并不直接参与细胞周期的调控，其激活也不需要磷酸化状态或与细胞周期蛋白结合。

CDK5 是一个极具吸引力的药理学靶点，因为它的失调与多种神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病）以及各类癌症有关。

工作原理

总 CDK5 检测原理

总 CDK5 检测可定量细胞裂解物中 CDK5 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。该检测使用两种标记抗体，一种偶联有供体荧光团，另一种偶联有受体荧光团。两种抗体都对该蛋白质上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 CDK5 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达水平。

总 CDK5 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入 HTRF 总 CDK5 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 CDK5 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 CDK5 可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

使用 TMX-2172 PROTAC® 降解总 CDK5

将 U87-MG 细胞在 96 孔板中（25,000 个细胞 / 孔）培养 24 小时，然后用 3 种浓度的 CDK5 PROTAC（TMX-2172）、CDK5 弹头（TMX-2039）或 CRBN 结合剂（泊马度胺）在 37°C、5% CO₂条件下处理 6 小时。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 总 CDK5 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。与经 CDK5 弹头和 CRBN 配体处理的细胞（信号无变化）相比，CDK5 PROTAC 诱导 CDK5 蛋白降解，信号降低 85%。

通过 ATPlite™检测测得的 ATP 水平保持恒定，这表明这些化合物对细胞增殖或活力没有影响。

HeLa 和 U87-MG 细胞中总 CDK5 的降解

将 HeLa 和 U87MG 细胞以 25,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。然后用浓度递增的 CDK5 PROTAC 处理细胞 6 小时，再用 50µL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。检测步骤中，将 16µL 细胞裂解物转移至小体积白色微孔板中，并加入 4µL 总 CDK5 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

经 CDK5 PROTAC 处理后，细胞中的 CDK5 呈剂量依赖性降解。

使用 HAP1-KO 细胞验证总 CDK5 的特异性

使用 HTRF 总 CDK5 试剂盒评估野生型 HAP1（WT）和 CDK5 敲除 HAP1 细胞系中 CDK5 的表达水平。事先对细胞密度进行了优化，以确保 HTRF 检测在试剂盒的动态范围内（数据未显示）。

将不同的细胞系在 96 孔板中于 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。移除培养基后，用 50µL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞，然后将 16µL 细胞裂解物转移至小体积白色微孔板中，接着加入 4µL 预混合的检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在 HAP1 CDK5 敲除细胞中，HTRF 信号与非特异性信号相当，这表明 CDK5 基因完全沉默；而正如预期的那样，在野生型细胞系中能很好地检测到 CDK5 水平。该结果表明 HTRF CDK5 试剂盒仅能特异性检测 CDK5 蛋白。

多种细胞系中总 CDK5 的检测

将贴壁的人细胞系 HeLa、U87-MG、HCT116、SHSY5Y 或小鼠 Neuro2A 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用补充的裂解缓冲液裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 CDK5 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

HTRF 总 CDK5 检测能有效检测多种表达不同水平该蛋白的细胞模型中的 CDK5。

HTRF（人 / 鼠）总 CDK5 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时并移除细胞培养基后，用 3mL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

用补充的 1 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 CDK5 检测试剂。

使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。

在这些条件下，HTRF 总 CDK5 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 32 倍。

简化通路

CDK5 信号通路

细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）是一组丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶，它们调控有丝分裂后的过程，如神经元活动、发育过程中的神经元迁移以及神经突生长。CDK5 的激活需要其与调节亚基 p35 结合。p35 是一种短寿命蛋白，其被 CDK5 靶点磷酸化后会发生泛素介导的蛋白水解。钙蛋白酶 1 也会直接切割 p35，释放出一种 25kD 的蛋白产物，这会导致 CDK5 的持续激活和错误定位，以及 Tau 蛋白的过度磷酸化。

此外，CDK5 的激活会通过双链断裂（DSBs）促进 DNA 损伤，进而通过激活 DNA 损伤应答导致细胞周期调节因子（如细胞周期蛋白和 pRb）的水平升高。CDK5 还通过磷酸化 ATM 对 DNA 损伤作出反应，这会通过 p53 导致细胞死亡。CDK5 还会磷酸化其他底物，如 Rb、Akt、p21、STAT3 和 CDK1，这些底物都参与细胞周期进程，从而导致细胞周期的异常激活。

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64CDK5TPEY

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