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HTRF (H/M) CDK8 TOTAL KIT - 500 PTS

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品牌： Revvity

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概述

CDK8 及其旁系同源物 CDK19，也被称为 “中介体激酶”，是细胞周期蛋白依赖性激酶，与细胞内稳态和发育程序相关。CDK8 和 CDK19 以互斥的方式整合到一个名为中介体激酶模块的 4 蛋白复合体中。该模块与中介体（一个调控 RNA 聚合酶 II 介导的基因表达的 26 亚基蛋白复合体）可逆结合。CDK8 与多种人类疾病的发生发展相关，尤其是癌症。

工作原理

总 CDK8 检测原理

总 CDK8 检测用于定量细胞裂解物中 CDK8 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。该检测使用两种标记抗体，一种与供体荧光团偶联，另一种与受体荧光团偶联。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 CDK8 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中该蛋白的浓度直接成正比，并在免洗涤的检测格式下为评估蛋白的表达水平提供了手段。

human-mouse-total-CDK8-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK8 检测试剂盒）

总 CDK8 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入 HTRF 总 CDK8 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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总 CDK8 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 CDK8 可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化操作，同时保持稳定的 HTRF 质量。

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检测验证

使用 JH-XI-10-02 PROTAC® 降解总 CDK8

将 HT29 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）培养 24 小时，然后在 37°C、5% CO₂条件下，用 3 种浓度的 CDK8 PROTAC（JH-XI_10-02）、CDK8 弹头（皮质抑素衍生物）或 CRBN 结合剂（泊马度胺）处理 24 小时。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 总 CDK8 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。与经 CDK8 弹头和 CRBN 配体处理的细胞（信号无变化）相比，CDK8 PROTAC 诱导 CDK8 蛋白部分降解，信号降低 41%。

通过 ATPlite™检测测得的 ATP 水平恒定，表明这些化合物对细胞增殖或活力无影响。

human-mouse-total-CDK8-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK8 检测试剂盒）

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HT-29 和 Jurkat 细胞中总 CDK8 的降解

将 HT-29 和 Jurkat 细胞以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。然后用递增浓度的 CDK8 PROTAC（JH-XI-10-02）处理细胞 24 小时，之后用 50µL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。在检测步骤中，将 16µL 细胞裂解物转移至小体积白色微孔板中，并加入 4µL 总 CDK8 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

用 CDK8 PROTAC 处理细胞可诱导 Jurkat 和 HT-29 细胞中 CDK8 蛋白的部分降解（分别降解 50% 和 40%）。

human-mouse-total-CDK8-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK8 检测试剂盒）

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使用 siRNA 验证总 CDK8 的特异性

将 HT-29 细胞以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，培养 24 小时。然后用针对 CDK8 和 CDK19 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。

孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，随后加入 4µL HTRF 总 CDK8 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，转染 CDK8 siRNA 的细胞信号降低了 83%。转染 CDK19 siRNA 的细胞未观察到信号降低。这些数据表明，HTRF 总 CDK8 检测对 CDK8 蛋白的检测具有特异性，且不会与 CDK19 发生交叉反应。

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不同细胞系中总 CDK8 的检测

将贴壁的人细胞系 HeLa、HT-29、HCT116 或小鼠 NIH-3T3 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用补充的裂解缓冲液裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 CDK8 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

HTRF 总 CDK8 检测能有效检测各种表达不同水平该蛋白的细胞模型中的 CDK8。

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HTRF（人 / 小鼠）总 CDK8 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HT-29 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时并移除细胞培养基后，用 3mL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。

使用补充的 1 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 CDK8 检测试剂。

使用等量的裂解物对 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行比较。

在这些条件下，HTRF 总 CDK8 检测的灵敏度是蛋白质印迹技术的 16 倍。

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简化通路

CDK8 信号通路

传统上，CDK 分为两个亚家族：协调细胞周期进程的 CDK（CDK1、CDK2、CDK4 和 CDK6）和转录 CDK（CDK7、CDK8、CDK9、CDK12 和 CDK13）。CDK8 / 周期蛋白 C 与 Med12 和 Med13 一起构成中介体复合体中的一个子模块，该子模块被认为起着分子开关的作用，抑制 RNA 聚合酶 II 的募集和转录起始。

CDK8 子模块可独立于中介体复合体直接与转录因子相互作用，从而调控信号通路。这些作用包括 NOTCH 依赖性信号传导、转化生长因子 -β（TGF-β）和骨形态发生蛋白（BMP）受体信号传导，以及信号转导和转录激活因子（STAT）信号传导。

human-mouse-total-CDK8-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK8 检测试剂盒）

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总量
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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