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HTRF (H/M) CDK8 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

CDK8 及其旁系同源物 CDK19，也被称为 “中介体激酶”，是细胞周期蛋白依赖性激酶，与细胞稳态和发育程序调控相关。CDK8 和 CDK19 以互斥的方式整合到一个由 4 种蛋白质组成的复合体中，该复合体被称为中介体激酶模块。此模块与中介体（一种由 26 个亚基组成、调控 RNA 聚合酶 II 介导的基因表达的蛋白质复合体）可逆结合。CDK8 与多种人类疾病的发生发展相关，尤其是癌症。

作用原理

总 CDK8 检测原理
总 CDK8 检测用于定量细胞裂解物中 CDK8 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此检测使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 CDK8 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达水平。

人 - 鼠总 CDK8 检测试剂盒

总 CDK8 双板检测方案
双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后添加 HTRF 总 CDK8 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

人 - 鼠总 CDK8 检测试剂盒

总 CDK8 单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测总 CDK8 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证
使用 JH-XI-10-02 PROTAC® 降解总 CDK8
将 HT29 细胞在 96 孔板中培养（每孔 50,000 个细胞）24 小时，然后分别用 3 种浓度的 CDK8 PROTAC（JH-XI_10-02）、CDK8 弹头化合物（皮质抑素衍生物）或 CRBN 结合剂（泊马度胺）在 37°C、5% CO₂条件下处理 24 小时。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 总 CDK8 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。与经 CDK8 弹头化合物和 CRBN 配体处理的细胞（信号无变化）相比，CDK8 PROTAC 可诱导 CDK8 蛋白部分降解，信号降低 41%。

通过 ATPlite™检测测得的 ATP 水平稳定，表明这些化合物对细胞增殖或活力无影响。

人 - 鼠总 CDK8 检测试剂盒

HT-29 和 Jurkat 细胞中总 CDK8 的降解
将 HT-29 和 Jurkat 细胞以每孔 50,000 个细胞的密度接种到含完全培养基的 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。然后用不同浓度的 CDK8 PROTAC（JH-XI-10-02）处理细胞 24 小时，之后用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。检测时，将 16 µL 细胞裂解物转移到小体积白色微孔板中，并加入 4 µL 总 CDK8 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

用 CDK8 PROTAC 处理细胞后，Jurkat 细胞和 HT-29 细胞中的 CDK8 蛋白含量分别部分降解了 50% 和 40%。

人 - 鼠总 CDK8 检测试剂盒

使用 siRNA 验证总 CDK8 检测的特异性
将 HT-29 细胞接种到 96 孔板中（每孔 50,000 个细胞）并培养 24 小时。然后用针对 CDK8 和 CDK19 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。

孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 CDK8 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，转染 CDK8 siRNA 的细胞信号降低了 83%。而转染 CDK19 siRNA 的细胞未观察到信号降低。这些数据表明，HTRF 总 CDK8 检测对 CDK8 蛋白的检测具有特异性，且不会与 CDK19 发生交叉反应。

人 - 鼠总 CDK8 检测试剂盒

不同细胞系中的总 CDK8 检测
将贴壁的人细胞系 HeLa、HT-29、HCT116 或小鼠 NIH-3T3 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用补充的裂解缓冲液裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 CDK8 检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

HTRF 总 CDK8 检测能有效检测不同细胞模型中表达水平各异的 CDK8。

人 - 鼠总 CDK8 检测试剂盒

HTRF（人 / 鼠）总 CDK8 检测与蛋白质印迹法的比较
将 HT-29 细胞在含完全培养基的 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时并去除细胞培养基后，用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。

用补充的 1 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 CDK8 检测试剂。

使用等量的裂解物对 HTRF 检测和蛋白质印迹法进行平行比较。

在这些条件下，HTRF 总 CDK8 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 16 倍。

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简化通路
CDK8 信号通路
CDK 通常分为两个亚家族：协调细胞周期进程的 CDK（CDK1、CDK2、CDK4 和 CDK6）和转录相关的 CDK（CDK7、CDK8、CDK9、CDK12 和 CDK13）。CDK8 / 细胞周期蛋白 C 与 Med12 和 Med13 一起构成中介体复合体中的一个子模块，该子模块被认为可作为分子开关，抑制 RNA 聚合酶 II 的募集和转录起始。

CDK8 子模块可独立于中介体复合体直接与转录因子相互作用，从而调控信号通路。这些作用包括 NOTCH 依赖性信号通路、转化生长因子 -β（TGF-β）和骨形态发生蛋白（BMP）受体信号通路，以及信号转导和转录激活因子（STAT）信号通路。

人 - 鼠总 CDK8 检测试剂盒

规格参数

其他规格
应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 2、裂解缓冲液 3、裂解缓冲液 4
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
目标类别：磷蛋白
目标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 次检测

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货号：64CDK8TPEY

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