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HTRF (H) CHK2 TOTAL KIT - 50K PTS

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品牌： Revvity

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概述

Total-CHK1 细胞检测试剂盒旨在监测 CHK1 的表达水平，无论其是否磷酸化。

该试剂盒与我们的 Phospho-CHK1 ser 345 试剂盒兼容，能够从单个样本中分析磷酸化蛋白和总蛋白，从而更好地解读 ATR/CHK1 通路。

工作原理
HTRF Total CHK1 检测原理
Total-CHK1 检测可量化细胞裂解物中 CHK1 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。

Total-CHK1 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 CHK1 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样本中蛋白质的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质表达的方法。

人 - 鼠总 CHK1 检测试剂盒

HTRF Total-CHK1 双板检测方案
双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，最后添加 Total-CHK1 HTRF 检测试剂。

该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

人 - 鼠总 CHK1 检测试剂盒

Total-CHK1 单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测总 CHK1 可在单个板中进行，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。

这种为高通量筛选设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

人 - 鼠总 CHK1 检测试剂盒

检测验证
人 / 鼠 CHK1 检测兼容性：新制癌菌素剂量反应曲线
将人 HEK293 细胞或鼠 NIH/3T3 细胞接种在 96 孔培养处理板中（每孔 100,000 个细胞），加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育过夜。用新制癌菌素按剂量梯度处理细胞 2 小时（37°C、5% CO₂）。移除培养基后，用 50 µl 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF Phospho CHK1（Ser 345）或 Total-CHK1 检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

如预期所示，新制癌菌素诱导单链 DNA 损伤，导致 CHK1 磷酸化呈剂量依赖性增加，而对人或鼠细胞系中总蛋白的表达水平没有任何影响。

人 - 鼠总 CHK1 检测试剂盒

诱导 DNA 损伤的化合物对 CHK1 磷酸化和总蛋白的影响
将人 HEK293 细胞接种在 96 孔培养处理板中（每孔 100,000 个细胞），加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育过夜。用新制癌菌素、羟基脲、阿霉素和依托泊苷按剂量梯度处理细胞 2 小时（37°C、5% CO₂）。然后移除培养基，用 50 µl 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF Phospho CHK1（Ser 345）或 Total-CHK1 检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

不同化合物显示出不同的反应。新制癌菌素、羟基脲和依托泊苷会诱导单链断裂（SSB），从而诱导 CHK1 的完全磷酸化。而倾向于诱导双链断裂（DSB）的阿霉素则会导致 CHK1 的部分磷酸化。新制癌菌素、羟基脲、依托泊苷和阿霉素的 EC50 分别为 1.2 µM、0.1 mM、3.3 µM 和 7.1 µM。

此外，新制癌菌素的 EC80 经测定为 3 µM，该浓度用于评估 ATR/CHK1 通路的抑制剂。

这 4 种化合物均未影响 CHK1 总蛋白的表达水平。

人 - 鼠总 CHK1 检测试剂盒

ATR/CHK2 或 ATM/CHK2 通路抑制剂对 CHK1 磷酸化和总蛋白的影响
将人 HEK293 细胞接种在 96 孔培养处理板中（每孔 100,000 个细胞），加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育过夜。用 3 种 ATR 或 ATM 通路抑制剂按剂量梯度处理细胞 2 小时（37°C、5% CO₂）。然后用 3 µM 新制癌菌素（EC80）处理细胞，在 37°C、5% CO₂ 条件下再孵育 2 小时。移除培养基，用 50 µl 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF Phospho CHK1（Ser 345）或 Total-CHK1 检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

咖啡因是一种温和的 ATR/ATM 通路抑制剂，UCN-1 是一种强效的 CHK1 抑制剂，而 KU55933 仅是一种 ATM 通路抑制剂。如预期所示，UCN-1 能够以高效力（IC50 为 15 nM）完全抑制 CHK1 磷酸化，而咖啡因的效力较弱。KU55933 化合物不会抑制 CHK1 磷酸化。

最后，这 3 种受试抑制剂均未影响 CHK1 总蛋白的表达水平。

人 - 鼠总 CHK1 检测试剂盒

HTRF Total CHK1 检测与蛋白质印迹法的比较
HEK293 细胞在 T175 培养瓶中，于完全培养基中、37°C、5% CO₂ 条件下培养至汇合。

移除培养基后，用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的 1X 裂解缓冲液 #1 对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 的纯样本和每个稀释样本转移到 384 孔小体积微孔板中，然后加入 4µL HTRF Total CHK1 检测试剂。过夜后记录信号。

将等量的裂解物上样到凝胶中，以进行 HTRF 与蛋白质印迹法的并列比较。

在这些条件下，HTRF 总 CHK1 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 8 倍。

人 - 鼠总 CHK1 检测试剂盒

简化通路
ATM/CHK2 和 ATR/CHK1 信号通路
双链断裂（DSBs）或单链断裂（SSBs）是最有害的损伤之一，可能威胁基因组的完整性。这类损伤可由细胞代谢物的作用或 DNA 损伤剂（如遗传毒性化合物、化疗药物、紫外线（UV）照射或电离辐射）引起。

DNA 损伤反应（DDR）主要由共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ATM）和共济失调毛细血管扩张症和 Rad3 相关蛋白（ATR）控制，它们是磷酸肌醇 3 - 激酶（PI3K）相关激酶（PIKK）蛋白激酶家族的两个成员。

响应 DNA 损伤（SSBs）时，ATR–Chk1 通路和复制检查点反应被激活，介导 G2/M 检查点以阻止细胞周期进程，并为 DNA 修复争取额外时间。ATR 通过其相互作用伙伴 ATRIP 被招募到单链 DNA-RPA 处，这会导致 Chk1 的磷酸化和激活。CHK1 的激活涉及信号转导通路，直至调节 cdc2 / 细胞周期蛋白 B1 活性和控制 Cdc25A。

许多癌症在 G1/S 检查点存在缺陷，包括那些 p53 功能缺陷的癌症。如果由于 DNA 损伤导致 G1 检查点缺陷的细胞中 ATR 通路受到抑制，细胞将无法引发细胞周期停滞以进行 DNA 修复，从而导致癌细胞死亡。因此，抑制 ATR 通路已成为一种有吸引力的策略，可选择性地使 p53 缺陷细胞对损伤 DNA 的化疗药物敏感。

新型小分子 Chk1 和 Chk2 抑制剂的发现以及检查点调节新策略的验证，与传统的放疗和化疗方式相结合，有望改善癌症的治疗效果。

人 - 鼠总 CHK1 检测试剂盒

规格

其他规格
应用
细胞信号传导
兼容自动化
是
品牌
HTRF
检测方式
HTRF
兼容的裂解缓冲液
裂解缓冲液 1
裂解缓冲液 2
裂解缓冲液 4
分子修饰
总蛋白
产品类别
试剂盒
样本体积
16 µL
运输条件
干冰运输
目标类别
磷酸化蛋白
目标物种
人
鼠
技术
时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域
肿瘤学与炎症
单位规格
500 个检测点

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货号：64CHK2TPEY

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