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HTRF (H/M) COFILIN P-S3 KIT - 500 PTS

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品牌： Revvity

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概述


本试剂盒旨在快速检测细胞上清液和全细胞中丝氨酸 3 位磷酸化的丝切蛋白（Phospho Cofilin Ser3）。肌动蛋白结合蛋白是一类丰富的细胞蛋白，通过介导肌动蛋白聚合和重塑来调节细胞功能。丝切蛋白作为肌动蛋白丝动态的调节因子，是一种约 21kDa 的小分子蛋白，在所有脊椎动物中广泛表达，并在真核细胞中自由扩散。激酶使丝氨酸 3 位磷酸化会减弱丝切蛋白的肌动蛋白结合活性。相反，丝氨酸 3 位去磷酸化会增强丝切蛋白诱导的肌动蛋白解聚。


工作原理

磷酸化丝切蛋白（丝氨酸 3）检测原理

磷酸化丝切蛋白（丝氨酸 3）检测用于测量丝氨酸 3 位磷酸化的丝切蛋白。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基

于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。该检测使用两种抗体，一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能独立于蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会形成涉及两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，并在免洗涤的检测形式下为评估蛋白质的磷酸化状态提供了方法。


human-mouse-phospho-cofilin-detection-kit（人 / 小鼠磷酸化丝切蛋白检测试剂盒）

磷酸化丝切蛋白（丝氨酸 3）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入磷酸化丝切蛋白（丝氨酸 3）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

human-mouse-phospho-cofilin-detection-kit（人 / 小鼠磷酸化丝切蛋白检测试剂盒）

磷酸化丝切蛋白（丝氨酸 3）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化丝切蛋白（丝氨酸 3）可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

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检测验证

使用 LIMK1 抑制剂和星形孢菌素对 HTRF 磷酸化丝切蛋白（丝氨酸 3）/ 总丝切蛋白的调节作用

将 HeLa 细胞以 10,000 个细胞 / 孔的密度接种到完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。分别用浓度递增的星形孢菌素或 LIMK1 激酶（TH257）在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 1 小时或 2 小时。然后弃去上清液，向每个孔中加入 50µl 补充的 4 号裂解缓冲液。在轻轻振荡的条件下进行 30 分钟的裂解。将裂解物转移到 384 孔板中，每孔 16µl，然后加入 4µl 总丝切蛋白或丝氨酸 3 位磷酸化丝切蛋白检测试剂。过夜孵育后读取平板数据。

正如预期，两种化合物处理后均导致丝氨酸 3 位磷酸化的丝切蛋白减少，而总丝切蛋白的表达水平未受调节。

human-mouse-phospho-cofilin-detection-kit（人 / 小鼠磷酸化丝切蛋白检测试剂盒）

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神经细胞上的 HTRF 磷酸化丝切蛋白（丝氨酸 3）/ 总丝切蛋白

将人神经细胞以 10,000 个细胞 / 孔的密度接种到完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。分别用浓度递增的星形孢菌素或 LIMK1 激酶（TH257）在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 1 小时或 2 小时。然后弃去上清液，向每个孔中加入 50µl 补充的 4 号裂解缓冲液。在轻轻振荡的条件下进行 30 分钟的裂解。将裂解物转移到 384 孔板中，每孔 16µl，然后加入 4µl 总丝切蛋白或丝氨酸 3 位磷酸化丝切蛋白检测试剂。过夜孵育后读取平板数据。

正如预期，两种化合物处理后均导致丝氨酸 3 位磷酸化的丝切蛋白减少，而总丝切蛋白的表达水平未受调节。

human-mouse-phospho-cofilin-detection-kit（人 / 小鼠磷酸化丝切蛋白检测试剂盒）

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使用小干扰 RNA 验证 HTRF 磷酸化丝切蛋白（丝氨酸 3）检测的特异性

将 HeLa 细胞以 5,000 个细胞 / 孔的密度接种到完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用 50nmol 针对丝切蛋白 1 和 / 或丝切蛋白 2 的小干扰 RNA 转染细胞，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。然后移除转染培养基，向细胞上加入细胞培养基，在 37°C、5% CO₂条件下再孵育 24 小时。然后弃去上清液，向每个孔中加入 50µl 补充的 4 号裂解缓冲液。在轻轻振荡的条件下进行 30 分钟的裂解。将裂解物转移到 384 孔板中，每孔 16µl，然后加入 4µl 丝氨酸 3 位磷酸化丝切蛋白检测试剂。过夜孵育后读取平板数据。

丝切蛋白 1 小干扰 RNA 使丝切蛋白 1 磷酸化检测的信号降低了 90%，而丝切蛋白 2 则没有出现这种情况。数据表明，HTRF 磷酸化丝切蛋白 1 检测特异性检测丝切蛋白 1，且不与丝切蛋白 2 发生交叉反应。

human-mouse-phospho-cofilin-detection-kit（人 / 小鼠磷酸化丝切蛋白检测试剂盒）

丝氨酸 3 位磷酸化丝切蛋白检测在人源和鼠源细胞系中的通用性

将人源 HeLa 细胞、HepG2 细胞和鼠源 NIH-3T3 细胞以 12,500 个细胞 / 孔的密度接种到完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。然后弃去上清液，向每个孔中加入 50µl 补充的 4 号裂解缓冲液。在轻轻振荡的条件下进行 30 分钟的裂解。将裂解物转移到 384 孔板中，每孔 16µl，然后加入 4µl 丝氨酸 3 位磷酸化丝切蛋白检测试剂。过夜孵育后读取平板数据。

在多种人源和鼠源细胞模型中，磷酸化丝切蛋白均能被有效检测到。

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HTRF 与蛋白质印迹法检测丝氨酸 3 位磷酸化丝切蛋白的灵敏度比较

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。

先将细胞裂解物稀释 10 倍，然后使用补充的裂解缓冲液进行系列稀释，将 16µl 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4µl HTRF 丝氨酸 3 位磷酸化丝切蛋白检测试剂。使用等量的裂解物对 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行比较。

在这些条件下，HTRF 丝氨酸 3 位磷酸化丝切蛋白检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 32 倍。

human-mouse-phospho-cofilin-detection-kit（人 / 小鼠磷酸化丝切蛋白检测试剂盒）


简化通路

丝切蛋白信号通路

肌动蛋白结合蛋白是一类丰富的细胞蛋白，通过介导肌动蛋白聚合和重塑来调节细胞功能。丝切蛋白作为肌动蛋白丝动态的调节因子，是一种约 21kDa 的小分子蛋白，在所有脊椎动物中广泛表达，并在真核细胞中自由扩散。丝切蛋白通过增强 F - 肌动蛋白解聚和抑制 G - 肌动蛋白聚合来促进肌动蛋白丝的转化，这在真核生物的肌动蛋白丝动态过程中至关重要。激酶使丝氨酸 3 位磷酸化会减弱丝切蛋白的肌动蛋白结合活性。相反，丝氨酸 3 位去磷酸化会增强丝切蛋白诱导的肌动蛋白解聚。丝切蛋白的功能还受到多种结合伙伴或活性氧的调节。

尽管丝切蛋白介导的肌动蛋白动态机制已被了解数十年，但最近的研究揭示了丝切蛋白失调在神经退行性病理生理学中的深远影响。例如，氧化应激诱导的丝切蛋白去磷酸化增加与阿尔茨海默病中 tau 蛋白缠结和淀粉样 β 斑块的积累有关。在帕金森病中，通过沉默其上游激酶激活丝切蛋白会增加 α- 突触核蛋白原纤维进入细胞。丝切蛋白在癌细胞中也过度表达，促进细胞运动，并作为癌症转移的重要调节因子。

human-mouse-phospho-cofilin-detection-kit（人 / 小鼠磷酸化丝切蛋白检测试剂盒）


规格


其他规格

  • 应用：细胞信号传导
  • 品牌：HTRF
  • 检测方式：HTRF
  • 兼容的裂解缓冲液：4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
  • 分子修饰：磷酸化
  • 产品类别：试剂盒
  • 样品体积：16µL
  • 运输条件：干冰运输
  • 靶标类别：磷蛋白
  • 靶标物种：人、小鼠
  • 技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
  • 单位规格：500 个检测点


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货号：64COFS3PEG
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