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HTRF (H/M) COFILIN TOTAL KIT - 500 PTS

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品牌： Revvity

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概述

本试剂盒用于快速检测细胞上清液和全细胞中的总丝切蛋白（Total Cofilin）。肌动蛋白结合蛋白是一类丰富的细胞蛋白，通过介导肌动蛋白聚合和重塑来调节细胞功能。丝切蛋白作为肌动蛋白丝动态的调节因子，是一种约 21kDa 的小分子蛋白，在所有脊椎动物中广泛表达，并在真核细胞中自由扩散。

工作原理

总丝切蛋白检测原理

HTRF 总丝切蛋白检测可量化丝切蛋白的表达水平。该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测中使用两种抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。这两种抗体对蛋白上的不同表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在丝切蛋白时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白的浓度直接相关，且无需洗涤步骤即可评估蛋白的表达水平。

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总丝切蛋白双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔低体积检测板中，最后加入总丝切蛋白 HTRF 检测试剂。该方案可监测细胞活力和汇合度。

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总丝切蛋白单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总丝切蛋白可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

使用 LIMK1 抑制剂和星孢菌素调节 HTRF 磷酸化丝切蛋白（Ser3）/ 总丝切蛋白

将 HeLa 细胞以 10,000 个细胞 / 孔的密度接种在完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。然后用不同浓度的星孢菌素（Staurosporine）或 LIMK1 激酶抑制剂（TH257）分别处理细胞 1 小时或 2 小时（37°C、5% CO₂）。随后弃去上清液，向每孔加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液，在温和振荡条件下裂解 30 分钟。将裂解物以每孔 16µL 的体积转移到 384 孔板中，然后加入 4µL 总丝切蛋白或磷酸化丝切蛋白（Ser3）检测试剂，孵育过夜后读取平板数据。

正如预期，两种化合物处理后均导致丝切蛋白 Ser3 位点的磷酸化水平降低，而总丝切蛋白的表达水平未受影响。

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神经细胞中的 HTRF 磷酸化丝切蛋白（Ser3）/ 总丝切蛋白检测

将人神经细胞以 10,000 个细胞 / 孔的密度接种在完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用不同浓度的星孢菌素或 LIMK1 激酶抑制剂（TH257）分别处理细胞 1 小时或 2 小时（37°C、5% CO₂）。弃去上清液，向每孔加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液，在温和振荡条件下裂解 30 分钟。将裂解物以每孔 16µL 的体积转移到 384 孔板中，加入 4µL 总丝切蛋白或磷酸化丝切蛋白（Ser3）检测试剂，孵育过夜后读取平板数据。

正如预期，两种化合物处理后均导致丝切蛋白 Ser3 位点的磷酸化水平降低，而总丝切蛋白的表达水平未受影响。

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使用 SiRNA 验证 HTRF 总丝切蛋白检测的特异性

将 HeLa 细胞以 5,000 个细胞 / 孔的密度接种在完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用 50nmol 的针对丝切蛋白 1（Cofilin 1）和 / 或丝切蛋白 2（Cofilin 2）的 siRNA 转染细胞，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。然后移除转染培养基，加入细胞培养基，在 37°C、5% CO₂条件下继续培养 24 小时。弃去上清液，向每孔加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液，在温和振荡条件下裂解 30 分钟。将裂解物以每孔 16µL 的体积转移到 384 孔板中，加入 4µL 总丝切蛋白（Ser3）检测试剂，孵育过夜后读取平板数据。

结果显示，丝切蛋白 1 siRNA 使总丝切蛋白 1 的检测信号降低 58%，而丝切蛋白 2 siRNA 无此效果。数据表明，HTRF 总丝切蛋白 1 检测对丝切蛋白 1 具有特异性，与丝切蛋白 2 无交叉反应。

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总丝切蛋白检测在人源和鼠源细胞系中的通用性

将人源 HeLa 细胞、HepG2 细胞和鼠源 NIH-3T3 细胞以 12,500 个细胞 / 孔的密度接种在完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。弃去上清液，向每孔加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液，在温和振荡条件下裂解 30 分钟。将裂解物以每孔 16µL 的体积转移到 384 孔板中，加入 4µL HTRF 总丝切蛋白检测试剂，孵育过夜后读取平板数据。

结果显示，在多种人源和鼠源细胞模型中均可有效检测到总丝切蛋白。

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HTRF 与 WB 在总丝切蛋白检测中的灵敏度比较

HeLa 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中培养，37°C、5% CO₂条件下孵育 48 小时后，用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下温和振荡裂解 30 分钟。

将细胞裂解物先用裂解缓冲液稀释 10 倍，再进行系列稀释，取 16µL 各稀释液转移到低体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总丝切蛋白检测试剂。同时，取等量裂解物进行 HTRF 与 Western Blot（WB）的平行比较。

在此条件下，HTRF 总丝切蛋白检测的灵敏度是 WB 技术的 16 倍。

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简化通路

丝切蛋白信号通路

肌动蛋白结合蛋白是一类丰富的细胞蛋白，通过介导肌动蛋白聚合和重塑调节细胞功能。丝切蛋白作为肌动蛋白丝动态的调节因子，是一种约 21kDa 的小分子蛋白，在所有脊椎动物中广泛表达，并在真核细胞中自由扩散。丝切蛋白通过促进 F - 肌动蛋白解聚和抑制 G - 肌动蛋白聚合来推动肌动蛋白丝的转化，这在真核生物的肌动蛋白丝动态中至关重要。激酶介导的 Ser-3 位点磷酸化会减弱丝切蛋白的肌动蛋白结合活性，而 Ser-3 位点去磷酸化则会增强丝切蛋白诱导的肌动蛋白解聚。此外，丝切蛋白的功能还受多种结合伴侣或活性氧的调节。

尽管丝切蛋白介导的肌动蛋白动态机制已被研究数十年，但近年来的研究揭示了丝切蛋白失调在神经退行性病理中的深远影响。例如，氧化应激诱导的丝切蛋白去磷酸化增加与阿尔茨海默病中 tau 缠结和淀粉样 β 斑块的积累相关。在帕金森病中，通过沉默上游激酶激活丝切蛋白会增加 α- 突触核蛋白原纤维进入细胞。丝切蛋白在癌细胞中也存在过表达，可促进细胞运动，并作为癌症转移的重要调节因子。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容裂解缓冲液：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 2、裂解缓冲液 4、裂解缓冲液 5
分子修饰：总蛋白（Total）
产品类别：试剂盒（Kit）
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
目标类别：磷蛋白（Phosphoproteins）
目标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64COFTPEG

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