HTRF CRAF TOTAL KIT - 50K PTS

概述

总cRaf细胞检测试剂盒旨在通过简化的混合读取、无需洗涤方案，对总cRaf进行稳定定量。cRaf在细胞增殖和分化中起着关键作用。该试剂盒可用于从基础研究到高通量药物筛选等多个领域。其多功能性使其适用于多种应用场景，涵盖基础研究、细胞模型中的药理学问题分析，并且在肿瘤学和传染病研究中也有应用。工作原理总cRaf检测原理 总cRaf检测可对细胞裂解物中cRaf的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总cRaf检测使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在eNOS时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生FRET信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，为在无需洗涤的检测格式中评估蛋白质表达提供了一种方法。 总cRaf双板检测方案 双板方案包括先在96孔板中培养细胞，然后进行裂解。之后，将裂解物转移到384孔小体积检测板中，再添加HTRF总cRaf检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。 总cRaf单板检测方案 使用HTRF试剂检测总eNOS可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的HTRF质量。 检测验证 TPA刺激的HeLa细胞中总c-RAF和磷酸化c-RAF（S43）的检测 将HeLa细胞以100 µl的体积接种到96孔板中（每孔100,000个细胞），使用完全培养基，在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。次日，移除培养基，加入50 µl无血清培养基，在37°C、5% CO₂条件下使细胞饥饿5小时。然后，向细胞中加入50 µl不同浓度递增的TPA，在37°C、5% CO₂条件下处理15分钟。 移除培养基后，用50 µL补充的2号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞30分钟，将16 µL裂解物转移到小体积白色微孔板中，然后加入4 µL预混合的HTRF磷酸化cRaf（Ser43）或总cRaf检测试剂。孵育过夜后记录HTRF信号。 TPA刺激的HEK293T细胞中总c-RAF和磷酸化c-RAF（S43）的检测 将HEK293T细胞以100 µl的体积接种到96孔板中（每孔100,000个细胞），使用完全培养基，在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。次日，移除培养基，加入50 µl无血清培养基，在37°C、5% CO₂条件下使细胞饥饿5小时。然后，向细胞中加入50 µl不同浓度递增的TPA，在37°C、5% CO₂条件下处理15分钟。 移除培养基后，用50 µL补充的2号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞30分钟，将16 µL裂解物转移到小体积白色微孔板中，然后加入4 µL预混合的HTRF磷酸化cRaf（Ser43）或总cRaf检测试剂。孵育过夜后记录HTRF信号。 简化通路 RSK1的功能与调控 RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（c-RAF）是MAP激酶通路的一部分，它将上游效应因子Ras与下游MAPK/ERK级联反应连接起来。因此，它在细胞命运决定中发挥作用，包括增殖、分化、凋亡、存活和致癌转化。 c-RAF可通过PKC的直接或间接作用使Ser338磷酸化而被激活，也可通过与GTP结合的Ras直接作用而被激活。通过MAPK/ERK依赖性反馈使Ser43磷酸化可实现其失活。规格

其他规格 应用领域：细胞信号传导 兼容自动化：是 品牌：HTRF 检测方式：HTRF 分子修饰：总（蛋白） 产品类别：试剂盒 样品体积：16 µL 运输条件：干冰运输 目标类别：磷酸化蛋白 目标物种：人 技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET） 治疗领域：心血管、代谢/糖尿病、肿瘤学与炎症 单位规格：500个检测点