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HTRF CEREBLON TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

总脑蛋白（Cereblon）细胞检测可测量细胞中 E3 泛素连接酶脑蛋白（CRBN）的表达水平。

脑蛋白是一种广泛表达的蛋白质，在 CRL4-CRBN E3 泛素连接酶复合物中充当底物识别亚基，并通过泛素 - 蛋白酶体系统（UPS）靶向特定蛋白质进行蛋白水解。

脑蛋白在正常肢体生长、正常细胞增殖与代谢以及记忆和学习过程中发挥关键作用。

脑蛋白也是免疫调节药物（IMiDs）沙利度胺、泊马度胺和来那度胺的主要直接靶点，这些药物均为美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗多发性骨髓瘤的药物。有趣的是，免疫调节药物（IMiDs）最近已被衍生为 PROTAC 分子，以通过泛素 - 蛋白酶体系统（UPS）定向降解不需要的蛋白质。

工作原理

总脑蛋白检测原理

总脑蛋白检测可对细胞裂解物中脑蛋白的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总脑蛋白检测使用两种标记抗体，一种与供体荧光团偶联，另一种与受体荧光团偶联。两种抗体都对该蛋白质上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在脑蛋白时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质表达的方法。

总脑蛋白双板检测方案

双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后添加总脑蛋白 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总脑蛋白单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总脑蛋白可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

不同人和小鼠细胞系中脑蛋白水平的评估

将人源 HEK293、HepG2、HeLa 和 Jurkat 细胞系以及小鼠源 NIH-3T3 细胞系以不同细胞密度接种在 96 孔板中，培养 24 小时。然后用补充的 4 号裂解缓冲液裂解细胞，将 16μL 样品转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并添加 4μL HTRF 总脑蛋白检测抗体，对细胞裂解物中的总脑蛋白水平进行分析。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

小干扰 RNA（siRNA）实验对脑蛋白（CRBN）表达的敲低作用

将 HEK293 细胞接种在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔），培养 24 小时。然后用针对脑蛋白的 siRNA、针对 Von Hippel–Lindau（VHL）的 siRNA 以及阴性对照 siRNA 分别转染细胞。孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16μL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后添加 4μL HTRF 总脑蛋白检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，用脑蛋白 siRNA 转染细胞会导致脑蛋白（CRBN）表达敲低，表现为信号降低 76%，而用 VHL siRNA 或阴性 siRNA 转染细胞时，未观察到信号变化。

免疫调节药物（IMiDs）对脑蛋白水平的稳定作用

将 HEK293 细胞接种在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔），孵育 6 小时。然后用 0.1μM 和 10μM 的免疫调节药物（IMiDs）沙利度胺（TOCRIS，#0652）、来那度胺（TOCRIS，#6305）和泊马度胺（TOCRIS，#6302）处理细胞。过夜孵育后，裂解细胞，将 16μL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后添加 4μL HTRF 总脑蛋白检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，用沙利度胺及其衍生物来那度胺和泊马度胺处理细胞，通过抑制脑蛋白的泛素化和降解，导致脑蛋白水平的稳定和积累（Liu 等人，《沙利度胺及其类似物的一种新作用：抑制脑蛋白泛素化增强泛素连接酶功能》；《美国实验生物学学会联合会杂志》，2015 年 12 月；29（12）：4829-4839）。

HTRF 总脑蛋白检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的比较

将 HEK293 细胞在含完全培养基的 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16μL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后添加 4μL HTRF 总脑蛋白检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 总脑蛋白检测时，仅需 500 个细胞 / 孔就能检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法则需要 4,000 个细胞 / 泳道才能获得最小的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 总脑蛋白检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

简化通路

脑蛋白在 CRL4-CRBN E3 泛素连接酶复合物中的作用

脑蛋白（也称为 CRBN）是一种由 442 个氨基酸组成（55 kDa）的广泛表达的蛋白质。

CRBN 与 DNA 损伤结合蛋白 1（DDB1）、Cullin 4（Cul4）和 Cullins 1 调节因子（RoC1）相互作用，形成功能性 E3 泛素连接酶复合物。在该复合物中，CRBN 充当底物识别亚基，通过泛素 - 蛋白酶体系统（UPS）靶向蛋白质进行蛋白水解。因此，这种 E3 泛素连接酶复合物可以通过靶向不同的底物实现不同的细胞反应。

CRBN 在大脑中的表达与记忆和学习过程相关。无义突变（R419X）会导致非综合征性智力低下。

CRBN 还通过调节离子通道的功能来确保正常的细胞增殖和代谢。

此外，脑蛋白是免疫调节药物（IMiDs）沙利度胺、泊马度胺和来那度胺的主要直接靶点，这些药物均为 FDA 批准用于治疗多发性骨髓瘤的药物。这些药物通过 CRBN E3 泛素连接酶诱导淋巴转录因子 IKZF1 和 IKZF3 的泛素化和降解。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总量
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
目标类别：磷蛋白
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：炎症、神经科学、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64CRBNPEY

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