当前位置：首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > Phosphoproteins > HTRF (H/M) CYCLIN D1 TOTAL KIT - 50K PTS

HTRF (H/M) CYCLIN D1 TOTAL KIT - 50K PTS

分享给好友

rvty_ls_sds_64CYCD1TPEG_US rvty_ls_sds_64CYCD1TPEG_SPA rvty_ls_sds_64CYCD1TPEG_UK rvty_ls_sds_64CYCD1TPEG_ITA rvty_ls_sds_64CYCD1TPEG_ELL rvty_ls_sds_64CYCD1TPEG_DEU rvty_ls_sds_64CYCD1TPEG_FRA

收藏咨询

品牌： Revvity

产品详情
相关解决方案
相关资源
相关视频
相关问答

概述

基于细胞的总细胞周期蛋白 D1 检测试剂盒能够便捷且准确地检测细胞内总细胞周期蛋白 D1 的水平。该试剂盒与磷酸化细胞周期蛋白 D1（Thr286）试剂盒的缓冲液兼容，因此同一细胞裂解液可用于分析磷酸化蛋白和总蛋白群体。

细胞周期蛋白 D 家族成员（包括细胞周期蛋白 D1、细胞周期蛋白 D2 和细胞周期蛋白 D3）是细胞周期进程的重要调节因子。它们通过充当 CDK4/6 的变构调节因子，是生长因子依赖性 G1 期向 S 期过渡的关键介导者。

在细胞外有丝分裂刺激存在时，细胞周期蛋白 D1 会被上调，随后在激酶 GSK-3β 使其 Thr286 位点磷酸化后，通过蛋白酶体降解迅速下调。

细胞周期蛋白 D1 是一种癌基因，在许多人类癌症中过度表达。细胞周期蛋白 D1 水平的异常升高会导致 CDK4/6 活性失调，进而引发肿瘤发生。细胞周期蛋白 D1 的过度表达可能由基因扩增、染色体重排或蛋白质降解受损引起。

工作原理

总细胞周期蛋白 D1 检测原理

总细胞周期蛋白 D1 检测可定量细胞裂解液中细胞周期蛋白 D1 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总细胞周期蛋白 D1 检测使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在细胞周期蛋白 D1 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质表达的方法。

总细胞周期蛋白 D1 双板检测方案

双板方案包括在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解液转移到小体积检测板中，然后添加总细胞周期蛋白 D1 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总细胞周期蛋白 D1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总细胞周期蛋白 D1 可在单个用于培养、处理和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

通过 siRNA 敲低实验验证总细胞周期蛋白 D1 检测的特异性

将 MCF7 细胞接种在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）并培养 24 小时。然后用特异性靶向细胞周期蛋白 D1、细胞周期蛋白 D2 或细胞周期蛋白 D3 的 siRNA 以及用作阴性对照的非靶向 siRNA 转染细胞。用 siRNA 孵育 24 小时后，更换培养基再孵育 24 小时，然后用 10μM MG132 处理细胞 4 小时。细胞裂解后，将 16μL 裂解液转移到小体积白色微孔板中，并添加 4μL HTRF 总细胞周期蛋白 D1 检测抗体以检测总细胞周期蛋白 D1。同时，将 4μL 相同的裂解液转移到检测板的不同孔中，使用 HTRF GAPDH 管家基因检测试剂盒（货号 64GAPDHPEG、64GAPDHPEH）检测 GAPDH。两种检测均在孵育过夜后记录 HTRF 信号。

与转染非靶向 siRNA 的细胞相比，转染靶向细胞周期蛋白 D1 的 siRNA 使总细胞周期蛋白 D1 检测的信号降低了 78%。相反，敲低细胞周期蛋白 D2 和细胞周期蛋白 D3 并未引起任何信号降低。此外，管家蛋白 GAPDH 的水平不受 siRNA 处理的显著影响，这表明在存在细胞周期蛋白 D1 siRNA 的情况下，总细胞周期蛋白 D1 检测中观察到的信号降低并非由细胞毒性引起。综上所述，这些数据表明 HTRF 总细胞周期蛋白 D1 检测对细胞周期蛋白 D1 具有特异性，且不会与其他细胞周期蛋白 D 家族成员发生交叉反应。

在 MG132 存在下抑制细胞周期蛋白 D1 的蛋白酶体降解

将不同细胞密度的人纤维肉瘤细胞系 HT-1080 接种在 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，并在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用或不用 10μM MG132 处理细胞 4 小时，然后用 50μL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。在检测步骤中，将 16μL 细胞裂解液转移到小体积白色微孔板中，并添加 4μL HTRF 磷酸化细胞周期蛋白 D1（Thr186）或总细胞周期蛋白 D1 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，在蛋白酶体抑制剂 MG132 存在的情况下，磷酸化细胞周期蛋白 D1（Thr286）和总细胞周期蛋白 D1 的水平均升高，这是因为 MG132 阻断了蛋白质的泛素依赖性蛋白酶体降解并诱导其在细胞内积累。

依维莫司处理的乳腺癌细胞中细胞周期蛋白 D1 降解的诱导

将人乳腺癌细胞系 MCF7 以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔培养处理板的完全培养基中，并在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用不同浓度的依维莫司处理细胞，再孵育过夜，然后用 50μL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。在检测步骤中，将 16μL 细胞裂解液转移到小体积白色微孔板中，并添加 4μL 总细胞周期蛋白 D1 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

用 mTORC1 抑制剂依维莫司处理细胞后，细胞内细胞周期蛋白 D1 的含量呈剂量依赖性降低，这是由其降解引起的。这些结果与文献（Chen 等人，《美国生理学杂志 - 细胞生理学》，317: C244–C252, 2019）一致。

HTRF 总细胞周期蛋白 D1 检测与蛋白质印迹法的比较

MCF7 细胞在 T175 培养瓶中，使用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，用 10μM MG132 处理细胞 4 小时，然后用 3mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，将 16μL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后添加 4μL HTRF 总细胞周期蛋白 D1 检测试剂。使用等量的裂解液进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 总细胞周期蛋白 D1 检测时，400 个细胞 / 孔就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法则需要 12,500 个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 总细胞周期蛋白 D1 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 32 倍。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
兼容自动化：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 2、裂解缓冲液 4
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16μL
运输条件：干冰运输
目标类别：磷酸化蛋白
目标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64CYCD1TPEY

一键复制

参考价格 ¥ 545226.97

产品规格

请咨询￥545226.97

参考货期：3-4周

选择数量

当前规格1件起购

加入购物车询价