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HTRF (H) CYCLIN E1 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

E 型细胞周期蛋白在静止细胞向细胞周期过渡过程中发挥重要作用。已知的 E 型细胞周期蛋白有两种，即细胞周期蛋白 E1 和细胞周期蛋白 E2。细胞周期蛋白 E1 可激活 CDK2，诱导 S 期过渡以及与有丝分裂相关的 DNA 合成。细胞周期蛋白 E1 的过表达与多种癌症直接相关。

本试剂盒与总 CDK2 和磷酸化 CDK2 试剂盒（货号 64CDK2TPEG 和 64CDK2Y15PEG）的缓冲液兼容，因此同一份裂解物可用于分析总细胞周期蛋白 E1、总 CDK2 和酪氨酸 15 磷酸化 CDK2 的水平。

工作原理

总细胞周期蛋白 E1 检测原理

总细胞周期蛋白 E1 检测可对细胞裂解物中细胞周期蛋白 E1 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总细胞周期蛋白 E1 检测使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在细胞周期蛋白 E1 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，为在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质表达提供了一种方法。

总细胞周期蛋白 E1 双板检测方案

双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，再将裂解物转移到小体积检测板中，之后添加总细胞周期蛋白 E1 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总细胞周期蛋白 E1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总细胞周期蛋白 E1 可在单个用于培养、处理和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

使用羟基脲和阿非迪霉素上调总细胞周期蛋白 E1

将 HeLa 细胞在 96 孔板中（100,000 个细胞 / 孔）培养 6 小时，然后用浓度递增的羟基脲（单链断裂诱导剂）或阿非迪霉素（细胞周期阻滞剂）处理过夜。细胞裂解后，将 16μL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并添加 4μL HTRF 总细胞周期蛋白 E1 检测抗体。孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。

如预期所示，在羟基脲或阿非迪霉素存在的情况下，总细胞周期蛋白 E1 的水平升高。

使用诺考达唑抑制总细胞周期蛋白

将 HeLa 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 6 小时。接下来，用浓度递增的诺考达唑处理细胞 16 小时，然后用 50μL 补充的 2 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。检测步骤：将 16μL 细胞裂解物转移到小体积白色微孔板中，并添加 4μL 总细胞周期蛋白 E1 检测试剂。孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。

用诺考达唑（细胞周期阻滞剂）处理细胞后，细胞内细胞周期蛋白 E1 的含量呈剂量依赖性降低。

ATPlite™检测显示 ATP 水平保持稳定，这表明诺考达唑处理对细胞增殖或活力无影响。

使用 siRNA 实验验证 HTRF 人总细胞周期蛋白 E1 检测的特异性

将 HeLa 细胞接种在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）并培养 24 小时。然后用特异性针对细胞周期蛋白 E1 和细胞周期蛋白 E2 的 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。

孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16μL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后添加 4μL HTRF 总细胞周期蛋白 E1 检测抗体。孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。

与转染阴性 siRNA 的细胞相比，转染细胞周期蛋白 E1 siRNA 的细胞信号降低了 80%。转染细胞周期蛋白 E2 siRNA 的细胞未观察到信号降低。数据表明，HTRF 总细胞周期蛋白 E1 检测特异性检测细胞周期蛋白 E1，且不会与细胞周期蛋白 E2 发生交叉反应。

HTRF 人总细胞周期蛋白 E1 检测在人细胞系中的通用性

将贴壁的人细胞系 HeLa、MCF7、U20S 或 HAP1 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用补充的裂解缓冲液裂解细胞，将 16μL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后添加 4μL HTRF 总细胞周期蛋白 E1 检测试剂。孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。

HTRF 总细胞周期蛋白 E1 检测能有效检测表达不同水平该蛋白的多种细胞模型中的细胞周期蛋白 E1。

HTRF 总细胞周期蛋白 E1 检测与蛋白质印迹法的比较

将 U2OS 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时并移除细胞培养基后，用 3mL 补充的 2 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的 2 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16μL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后添加 4μL HTRF 总细胞周期蛋白 E1 检测试剂。

使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

在这些条件下，HTRF 总细胞周期蛋白 E1 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 16 倍。

简化通路

细胞周期蛋白 E1 信号通路

细胞周期蛋白通过其定时表达以及结合、激活相关细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）并增强其底物亲和力的能力，在细胞分裂周期的有序进行中发挥关键作用。细胞周期蛋白 E1 和细胞周期蛋白 E2 是细胞周期蛋白依赖性激酶 2（CDK2）的激活剂。在哺乳动物细胞中，有丝分裂原刺激的 CDK4 或 CDK6 与 D 型细胞周期蛋白结合的活性在 G1 期促进细胞周期蛋白 E 的转录，并激活 CDK2 / 细胞周期蛋白 E 激酶活性。在 S 期，细胞周期蛋白 E 的水平下降，这是由于自身磷酸化和其他磷酸化事件导致细胞周期蛋白 E 被泛素化并通过蛋白酶体降解。细胞周期蛋白 E1 在 DNA 复制起始、组蛋白生物合成调控和中心体周期中直接发挥作用。细胞周期蛋白 E1 与多种恶性肿瘤的疾病进展相关，且在临床上与不良预后相关。

规格参数

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16μL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64CYCE1TPEY

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