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HTRF EIF2 ALPHA P-S52 KIT - 500 PTS 磷酸化真核起始因子2检测试剂盒–500测试

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概述

磷酸化 EIF2α 检测试剂盒旨在基于细胞对 EIF2α 上的 Ser52 磷酸化进行定量检测。在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）中，肝细胞内的脂质蓄积（脂肪变性）会诱导氧化应激和内质网应激，导致磷酸化 EIF2α（Ser52）水平升高。磷酸化的 EIF2α 会减少整体蛋白质合成，并激活 ATF4（激活转录因子 4），而 ATF4 会调节参与代谢调控、营养摄取、细胞氧化还原状态及细胞凋亡的特定基因的表达。

工作原理

磷酸化 EIF2α（Ser52）检测原理

磷酸化 EIF2α（Ser52）检测可测量 Ser52 位点磷酸化的 EIF2α。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 EIF2α（Ser52）检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能独立于磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且在免洗涤的检测形式下为评估蛋白质的磷酸化状态提供了方法。

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磷酸化 EIF2α（Ser52）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 EIF2α（Ser52）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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磷酸化 EIF2α（Ser52）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 EIF2α（Ser52）可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中完成，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

人 HeLa 细胞上 HTRF 与 WB 磷酸化 EIF2α 检测的比较

HeLa 细胞在添加 10% 胎牛血清的 MEMα 培养基中的 T175 cm² 培养瓶中培养 2 天。在 37°C 条件下，用 100 nM 花萼海绵诱癌素 A 处理细胞 10 分钟，然后用 3 mL 1X 补充的 4 号裂解缓冲液裂解细胞。用补充的 4 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取 16 µL 各稀释液分别通过 HTRF 或蛋白质印迹法进行平行分析。结果显示，HTRF 磷酸化 EIF2α 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 16 倍。

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黄常山碱对总 EIF2α 和磷酸化（Ser52）EIF2α 的药物作用

用不同浓度的黄常山碱处理 HepG2 和 NIH-3T3 细胞。裂解后，将裂解物转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。黄常山碱处理使 EIF2α 的 Ser52 磷酸化水平显著升高，而其表达水平保持稳定。

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毒胡萝卜素对总 EIF2α 和磷酸化（Ser52）EIF2α 的药物作用

用毒胡萝卜素（一种通过诱导内质网应激来抑制肌浆 / 内质网 Ca²⁺/ATP 酶的抑制剂）在 HepG2 细胞上进行剂量反应实验。采用双板方案，用不同浓度的毒胡萝卜素处理细胞并裂解。将裂解物两次转移至小体积白色微孔板中，最后加入 HTRF 磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。结果显示，EIF2α 的表达水平保持稳定，表明该化合物对细胞无细胞毒性作用。

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GSK2606414 对总 EIF2α 和磷酸化（Ser52）EIF2α 的药物作用

培养 HepG2 和 C2C12 细胞，用不同浓度的 GSK2606414（一种选择性 PERK 抑制剂）处理后，再用 500 nM 毒胡萝卜素激活。移除培养基后，裂解细胞，将 16 µL 裂解物两次转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

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棕榈酸对总 EIF2α 和磷酸化（Ser52）EIF2α 的药物作用

采用双板检测方案，用棕榈酸与牛血清白蛋白的结合溶液在 HepG2 细胞上进行剂量反应实验。然后在 37°C、5% CO₂条件下，用不同浓度的棕榈酸 / 牛血清白蛋白处理细胞 6 小时。加入裂解缓冲液后，将 16 µL 裂解物两次转移至小体积白色微孔板中，最后加入磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。记录 HTRF 信号，通过双向方差分析测试，结果表明棕榈酸可显著提高 EIF2α 在 Ser52 位点的磷酸化水平。

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简化通路

EIF2α 的功能与调控

EIF2（真核起始因子 2）通过将起始甲硫氨酰 tRNA 转移到核糖体的 40S 核糖体亚基，在蛋白质翻译起始过程中发挥作用。在多种细胞应激条件下，EIF2α 亚基的磷酸化是一种下调整体蛋白质合成的机制，这能使细胞节省资源，同时启动新的基因表达程序以防止应激损伤。细胞应激有多种类型，如内质网应激、氨基酸缺乏或氧化应激。有四种激酶可响应特定类型的应激磷酸化 EIF2α：HRI（红细胞中血红素缺乏时）、GCN2（氨基酸缺乏和营养剥夺时）、PKR（病毒感染时）和 PERK（内质网应激时）。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化
单位规格：500 个检测点

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货号：64EF2PEG

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