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HTRF EIF2 ALPHA P-S52 KIT - 50K PTS

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概述

磷酸化 EIF2α 检测试剂盒旨在基于细胞对 EIF2α 上 Ser52 位点的磷酸化进行定量检测。在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）中，肝细胞内的脂质堆积（脂肪变性）会诱发氧化应激和内质网应激，进而导致磷酸化 EIF2α（Ser52）水平升高。磷酸化的 EIF2α 会减少整体蛋白质合成，并激活转录激活因子 4（ATF4），而 ATF4 会调控参与代谢调节、营养摄取、细胞氧化还原状态及细胞凋亡相关特定基因的表达。

工作原理

磷酸化 EIF2α（Ser52）检测原理

磷酸化 EIF2α（Ser52）检测可对 Ser52 位点磷酸化的 EIF2α 进行测量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此检测采用两种标记抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接相关，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 EIF2α（Ser52）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，之后再加入磷酸化 EIF2α（Ser52）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 EIF2α（Ser52）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 EIF2α（Ser52）可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

人 HeLa 细胞中 HTRF 与 WB 磷酸化 EIF2α 检测对比

HeLa 细胞在添加 10% 胎牛血清（FBS）的 MEMα 培养基中，于 T175 cm² 培养瓶中培养 2 天。在 37°C 条件下，用 100 nM 花萼海绵诱癌素 A（Calyculin A）处理细胞 10 分钟，随后用 3 mL 的 1X 补充裂解缓冲液 #4 进行裂解。将细胞裂解物用补充裂解缓冲液 #4 进行系列稀释，取 16 µL 各稀释液分别通过 HTRF 和蛋白质印迹法进行平行分析。结果显示，HTRF 磷酸化 EIF2α 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 16 倍。

常山碱对总 EIF2α 和磷酸化（Ser52）EIF2α 的药效作用

用不同浓度的常山碱处理 HepG2 细胞和 NIH-3T3 细胞。裂解后，将裂解物转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果显示，常山碱处理能显著提高 EIF2α 的 Ser52 位点磷酸化水平，而其表达量保持稳定。

毒胡萝卜素对总 EIF2α 和磷酸化（Ser52）EIF2α 的药效作用

用毒胡萝卜素（一种通过诱发内质网应激来抑制肌浆网 / 内质网 Ca²⁺/ATP 酶的抑制剂）在 HepG2 细胞上进行剂量反应实验。采用双板方案，用不同浓度的毒胡萝卜素处理细胞后进行裂解，将裂解物两次转移至低体积白色微孔板中，最后加入 HTRF 磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。结果显示，EIF2α 的表达量保持稳定，表明该化合物对细胞无细胞毒性作用。

GSK2606414 对总 EIF2α 和磷酸化（Ser52）EIF2α 的药效作用

培养 HepG2 细胞和 C2C12 细胞，用不同浓度的 GSK2606414（一种选择性 PERK 抑制剂）处理后，再用 500 nM 毒胡萝卜素激活。移除培养基后裂解细胞，取 16 µL 裂解物两次转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

棕榈酸对总 EIF2α 和磷酸化（Ser52）EIF2α 的药效作用

采用双板检测方案，用与牛血清白蛋白（BSA）结合的棕榈酸溶液在 HepG2 细胞上进行剂量反应实验。在 37°C、5% CO₂条件下，用不同浓度的棕榈酸 / BSA 处理细胞 6 小时。加入裂解缓冲液后，取 16 µL 裂解物两次转移至低体积白色微孔板中，最后加入磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。记录 HTRF 信号，双向方差分析（2-way ANOVA）结果表明，棕榈酸能显著提高 EIF2α 的 Ser52 位点磷酸化水平。

简化通路

EIF2α 的功能与调控

真核起始因子 2（EIF2）在蛋白质翻译起始过程中发挥重要作用，它能将起始甲硫氨酰 tRNA 转移到核糖体的 40S 亚基上。在多种细胞应激条件下，EIF2α 亚基的磷酸化是一种下调整体蛋白质合成的机制，这使细胞能够节省资源，同时启动新的基因表达程序以避免应激损伤。细胞应激的类型多样，如内质网应激、氨基酸缺乏或氧化应激等。有四种激酶可响应不同类型的应激而磷酸化 EIF2α：HRI（红细胞中血红素缺乏时）、GCN2（氨基酸缺乏和营养匮乏时）、PKR（病毒感染时）以及 PERK（内质网应激时）。

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白质
靶标物种：人、小鼠
技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64EF2PEY

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