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HTRF (H) EGFR DEL19 TOTAL KIT - 500 PTS HTRF总表皮生长因子受体19号外显子缺失突变型检测试剂盒，500测试

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概述

在接受酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）治疗的 EGFR 突变型非小细胞肺癌患者中，耐药性是靶向癌症治疗面临的主要挑战之一。设计特异性 PROTAC 化合物来降解 EGFR 突变蛋白，有望为治疗此类患者和克服耐药性提供一种有前景的方法。

工作原理

总 EGFR EX19DEL 检测原理

HTRF 总 EGFR EX19DEL 检测可定量细胞裂解物中 19 号外显子缺失的 EGFR 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 EGFR EX19DEL 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对蛋白质上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 EGFR EX19DEL 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质的表达水平。

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总 EGFR EX19DEL 双板检测方案

双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，之后再加入总 EGFR EX19DEL HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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总 EGFR EX19DEL 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 EGFR EX19DEL 可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

PROTAC® 化合物诱导 EGFR Del19 突变体降解

将 HCC827 细胞以 30,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基培养，在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。然后用浓度递增的 PROTAC®（基于 MS39-SJF1528 - 吉非替尼的 PROTAC 3-MS154 和 SJF1521）在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 16 小时。用 50 µL 补充裂解缓冲液 #4 裂解细胞后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 总 EGFR DEL19 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，结果显示 PROTAC® 分子诱导 HCC827 细胞中突变型 EGFR Del19 呈剂量依赖性减少，并评估了每种化合物的 DC50*。在相同实验条件下，通过 ATPlite™检测测得的 ATP 水平稳定，表明未观察到细胞毒性作用。

DC50 指降解剂使 50% 的靶蛋白降解时的浓度。

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通过 siRNA 评估总 EGFR DEL19 试剂盒的特异性

将 H1650 细胞接种到 96 孔板中（10,000 个细胞 / 孔），培养 24 小时。然后用针对 EGFR、ERBB2、ERBB3 和 ERBB4 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 总 EGFR DEL19 检测抗体。

与转染阴性 siRNA 的细胞相比，EGFR siRNA 使信号降低了 92%。在转染 ERBB2、ERBB3 或 ERBB4 siRNA 的细胞中，未观察到信号降低。在相同实验条件下，通过 ATPlite™检测测得的 ATP 水平稳定，表明 EGFR 家族成员的沉默对细胞增殖或活力无影响。

这些结果表明，HTRF 总 EGFR DEL19 检测具有特异性，不会检测到其他 HER/ErbB 家族成员。

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总 EGFR DEL19 检测在相关 EGFR 突变细胞系中的验证

使用 HTRF 总 EGFR DEL19 试剂盒在不同细胞系中评估总 EGFR DEL19 的表达水平：H1975 和 H3255 细胞（表达 EGFR L858R 突变体）、A431 和 A549 细胞（表达野生型 EGFR）以及 H1650 和 HCC827 细胞（表达 EGFR DEL19 突变体）。

将不同细胞系在完全培养基中于 T175 培养瓶中在 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，用 3 mL 补充裂解缓冲液 #4（1X）在室温下轻轻摇晃 30 分钟以裂解细胞。将 16 µL 各稀释 2 倍的裂解物转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 总 EGFR DEL19 检测试剂。

正如预期的那样，在 H1975、H3255、A431 和 A549 细胞系中未检测到信号，这表明 HTRF 总 EGFR DEL19 试剂盒仅特异性检测突变型 EGFR DEL19。

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HTRF 总 EGFR DEL19 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HCC827 细胞在完全培养基中于 T175 培养瓶中在 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，用 3 mL 补充裂解缓冲液 #4（1X）在室温下轻轻摇晃 30 分钟以裂解细胞。

用补充裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 总 EGFR DEL19 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

在这些条件下，HTRF 总 EGFR DEL19 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 64 倍。

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简化通路

总 EGFR 信号通路

EGFR 是一种属于 ErbB 家族的受体酪氨酸激酶。EGFR 配体的结合会促使受体发生同源二聚化或异源二聚化，进而激活 EGFR 的酪氨酸激酶结构域和特定的酪氨酸残基。

磷酸化的酪氨酸残基随后会为多种因子提供停靠位点，这些因子会诱导多个信号转导级联反应的下游激活。

从 EGF 受体传递至细胞核的信号会调控多种生物学功能，如细胞增殖、分化、存活、黏附、迁移和血管生成。

导致 EGFR 过表达或过度激活的突变与多种癌症相关，这使得 EGFR 成为抗癌治疗的关键靶点。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64EGFRD19PEG

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