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HTRF ENOS TOTAL KIT - 500 PTS

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概述

总 eNOS 细胞检测可监测总 eNOS 的表达水平，且能与我们的磷酸化 eNOS（S1177）试剂盒配合使用，作为归一化检测。该试剂盒与磷酸化 eNOS 试剂盒的缓冲液兼容，因此同一份裂解物可用于分析磷酸化蛋白和总蛋白的含量。

eNOS 主要在内皮细胞中表达，其功能包括控制血管舒张、血压，以及发挥多种抗动脉粥样硬化和血管保护作用。

丝氨酸 1177 是 eNOS 最重要的磷酸化位点，对其活性具有正向调节作用。该位点的磷酸化受多种激酶调控，包括 AKT、PKA、AMPK、CaMKK2b 和 CHKI。

工作原理

总 eNOS 检测原理

总 eNOS 检测用于定量细胞裂解物中 eNOS 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 eNOS 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对蛋白质上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 eNOS 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质的表达水平。

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总 eNOS 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入总 eNOS HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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总 eNOS 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 eNOS 可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

血清饥饿与磷酸化积累

将人脐静脉内皮细胞（Huvec）以 80% 的汇合度接种到 160mm 培养皿中，在 37°C、5% CO₂条件下培养，进行或不进行过夜血清饥饿处理。随后，加入或不加入 30µM 的过钒酸盐溶液处理 30 分钟。移除培养基后，向每个培养皿中加入裂解缓冲液，摇晃孵育 30 分钟。然后将 16µl 裂解物转移至 384 孔板中，用于总 eNOS 和 Ser1177 磷酸化 eNOS 的检测。

饥饿处理似乎只会导致蛋白质含量略有下降，但会使磷酸化水平显著降低。过钒酸盐对磷酸化的积累效果显著。

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非诺贝特通过 AMPK 通路诱导 eNOS 磷酸化

将人脐静脉内皮细胞以 80% 的汇合度接种到 100mm 培养皿中，在 37°C、5% CO₂条件下培养，并进行过夜血清饥饿处理。随后，加入或不加入 30µM 的非诺贝特溶液处理 30 分钟。移除培养基后，加入裂解缓冲液。将 16µl 裂解物转移至 384 孔板中，用于总 eNOS 和 Ser1177 磷酸化 eNOS 的检测。

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总 eNOS 的蛋白质印迹法（WB）与 HTRF 检测比较

将人脐静脉内皮细胞在 160mm 培养皿中于 37°C、5% CO₂条件下培养 2 天。进行过夜血清饥饿处理后，用 30µM 过钒酸盐孵育 30 分钟。移除细胞培养基后，加入 3mL 补充裂解缓冲液，孵育 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。使用等量的裂解物进行蛋白质印迹法与 HTRF 检测的平行比较。总 eNOS 检测的灵敏度高于蛋白质印迹法：HTRF 检测仅需 37,500 个细胞 /mL 即可检测到，而蛋白质印迹法则需要 75,000 个细胞 /mL。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：心血管、代谢 / 糖尿病
单位规格：500 个检测点

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货号：64ENOSTPEG

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