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HTRF FGFR2 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

总 FGFR2 细胞检测可监测总 FGFR2 水平，且能与磷酸化 FGFR2 试剂盒配合使用，作为归一化检测。FGFR2 的突变与癌症（乳腺癌、黑色素瘤）及骨骼发育异常（颅缝早闭综合征）相关。

工作原理

总 FGFR2 检测原理
总 FGFR2 检测用于定量细胞裂解物中 FGFR2 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 FGFR2 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达水平。

总 FGFR2 双板检测方案
双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再加入总 FGFR2 HTRF 检测试剂。该方案可监测细胞的活力和汇合度。

总 FGFR2 单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测总 FGFR2 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证
多种人类癌细胞系中 FGFR 蛋白水平的评估
将不同的人类癌细胞系接种到 T175 培养瓶的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下培养。随后，用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

对每个细胞系的 25μg 总蛋白和 KG-1 细胞系的 15μg 总蛋白进行总 FGFR1-2-3 和 - 4 蛋白水平分析。将 16μL 标准化样品转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4μL 每种 HTRF 总 FGFR1-FGFR2-FGFR3 或 FGFR4 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果显示四种不同 FGFR 受体的表达模式存在差异：FGFR1 在 DMS114 肺癌细胞模型和 KG-1 骨髓性白血病模型中高表达；FGFR2 在 SNU-16 和 Kato-III 胃癌模型中优先表达；FGFR3 在 KMS-11 多发性骨髓瘤细胞系中表达；FGFR4 在 MDA-MD-453 乳腺癌模型或 HuH7 肝癌细胞系中表达。此外，这些结果证实了 HTRF 总 FGFR 试剂盒的识别特异性。

使用磷酸化 FGFR2（Tyr653/654）和总 FGFR2 试剂盒在 SNU-16 细胞上测量抑制效果
将人类 SNU-16 细胞（胃癌细胞）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到半区 96 孔培养板中，每孔加入 25μL 完全培养基。用 5μL 不同浓度的 FGFR 抑制剂 AZD4547 处理细胞，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 6 小时。处理后，用 10μL 补充的 4 号裂解缓冲液（4X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

细胞裂解后，将 16μL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 FGFR2（Tyr653/654）或总 FGFR2 检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

正如预期，结果显示经 AZD4547 处理后，FGFR2 Y653/654 磷酸化水平呈剂量依赖性抑制，而 FGFR2 的表达水平保持不变。

使用磷酸化 FGFR2（Tyr653/654）和总 FGFR2 试剂盒在 Kato-III 细胞上测量抑制效果
将人类 Kato-III 细胞（胃癌细胞）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到半区 96 孔培养板中，每孔加入 25μL 完全培养基。用 5μL 不同浓度的 FGFR 抑制剂 AZD4547 处理细胞，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 6 小时。处理后，用 10μL 补充的 4 号裂解缓冲液（4X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

正如预期，结果显示经 AZD4547 处理后，FGFR2 Y653/654 磷酸化水平呈剂量依赖性抑制，而 FGFR2 的表达水平保持不变。

使用磷酸化 FGFR2（Tyr653/654）和总 FGFR2 试剂盒在 NCI-H716 细胞上测量抑制效果
将人类 NCI-H716 细胞（结直肠腺癌）接种到 96 孔板中（100,000 个细胞 / 孔），孵育过夜。用不同浓度的 AZD4547 处理细胞，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 6 小时。处理后，用 50μL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

正如预期，结果显示经 AZD4547 处理后，FGFR2 Y653/654 磷酸化水平呈剂量依赖性抑制，而 FGFR2 的表达水平保持不变。

HTRF 总 FGFR2 检测与蛋白质印迹法的比较
将 SNU-16 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中培养，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 72 小时。随后，用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16μL 每种稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4μL HTRF 总 FGFR2 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 32 倍。

简化通路
简化的 FGFR 信号通路
FGFRs 是酪氨酸激酶受体，通过与 FGF 配体结合而被激活。这种结合会驱动受体同源二聚化，进而激活 FGFR 酪氨酸激酶结构域和特定酪氨酸残基的磷酸化。激活的受体成为多种蛋白质的停靠位点，这些蛋白质会诱导下游多个信号转导通路的激活，包括 RAS-MAPK、PI3K-AKT、PLCγ 和 STAT 通路。FRS2α 是与 FGFRs 持续结合的关键衔接蛋白。激活的 FGFRs 会磷酸化 FRS2，从而招募 GRB2 和 SOS 来激活 RAS 及下游的 RAF 和 MAPK 通路，尤其是 ERK1/2。GRB2 还通过 GAB1 激活 PI3K，PI3K 进而磷酸化 AKT。不依赖于 FRS2，PLCg 与激活的 FGFRs 胞内部分结合，通过水解 PIP2 生成 IP3 和 DAG。DAG 激活 PKC 酶，这在一定程度上会增强 MAPK 通路的激活。根据细胞环境的不同，FGFRs 还会激活其他通路，如 STAT 信号通路。从 FGFRs 传递到细胞核的信号会调控多种生物学功能，如细胞增殖、分化、存活、黏附、迁移和血管生成。在多种癌症中，FGFRs 的改变与 FGFRs 的过表达或过度活跃相关，这使得该受体成为抗癌治疗的关键靶点。

规格

其他规格
应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症、罕见病
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64FGFR2TPEY

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