概述
HTRF 人 FLT3(Fms 样酪氨酸激酶 3,又称 FLK2)检测试剂盒可监测野生型 FLT3(FLT3 WT)和 / 或内部串联重复(ITD)FLT3 突变体,用于检测多种细胞中内源性或过表达的 FLT3 的表达情况。FLT3 是一种 III 类受体酪氨酸激酶,在免疫细胞中表达,通过其配体 FLT3L 激活。与 FLT3L 结合后,FLT3 受体发生二聚化并激活多种通路,包括磷脂酰肌醇 3 - 激酶(PI3K)和 MAPK 通路,从而促进免疫细胞的分裂、增殖和存活。FLT3 通路的失调可能导致免疫细胞的无序增殖、未成熟化以及致癌表型。FLT3 是急性髓系白血病(AML)中最常见的突变基因。FLT3 基因的突变会导致受体激酶活性的持续激活,或破坏受体的自身抑制活性。ITD FLT3 突变体因其在 AML 中的作用而广为人知。因此,FLT3 突变体已成为制药行业的重要药物靶点。开发靶向 FLT3 降解的 PROTAC 化合物是针对白血病(如 AML)的治疗策略之一。
工作原理
HTRF 人总 FLT3 检测原理
HTRF 人总 FLT3 检测可定量细胞裂解物中 FLT3 的表达水平。与蛋白质印迹法(Western Blot)不同,该检测完全基于微孔板进行,无需凝胶、电泳或转膜步骤。人总 FLT3 检测使用两种标记抗体:一种偶联供体荧光团,另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 FLT3 时,添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近,从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比,且该检测采用无需洗涤的形式,为评估蛋白质的表达水平提供了手段。
人总 FLT3 双板检测方案
双板方案包括:先在 96 孔板中培养细胞,然后进行裂解,接着将裂解物转移至 384 孔小体积检测板,之后再加入人总 FLT3 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。
人总 FLT3 单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测人 FLT3 可在单个板中完成,该板可用于细胞培养、刺激和裂解,无需洗涤步骤。这种为高通量筛选(HTS)设计的方案能够实现微型化,同时保持可靠的 HTRF 质量。
检测验证
总 FLT3 检测的特异性
在 96 孔板中(100,000 个细胞 / 孔),用 100 ng 人 FLT3 质粒、空质粒转染 HEK293 细胞,或不进行转染,在 100 µL 体系中于 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。移除培养基后,用 50 µL 补充的 4 号裂解缓冲液(1X)在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟,将 16 µL 裂解物转移至小体积白色微孔板中,然后加入 4 µL 预混合的 HTRF 人总 FLT3 检测抗体。在室温下孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。
与空质粒转染的细胞相比,HTRF 人总 FLT3 检测能有效检测到人 FLT3 转染条件下的 FLT3。
在未转染细胞或空质粒转染细胞中未观察到信号,这证明了该试剂盒的特异性。
HTRF 人总 FLT3 试剂盒在内源性人白血病细胞系和瞬时过表达人 FLT3 的 HEK293 细胞上的验证
将人白血病 THP-1 细胞、人白血病 MV4-11 细胞和转染人 FLT3 的 HEK293 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中,于 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。用补充的 4 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟,THP-1 和 MV4-11 细胞的最终密度为 25×10⁶个细胞 /mL,转染的 HEK293 细胞的最终密度为 3×10⁶个细胞 /mL。
使用 HTRF 人总 FLT3 试剂盒评估 FLT3 蛋白的表达水平。简要步骤为:将 16 µL 细胞裂解物转移至小体积白色微孔板中,然后加入 4 µL 预混合的 HTRF 检测试剂。在室温下孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。
THP-1 细胞表达内源性野生型 FLT3(FLT3 WT),MV4-11 细胞表达内源性内部串联重复(ITD)FLT3 突变体,HEK293 细胞过表达 FLT3 WT。在所有测试的人细胞系中均检测到了不同水平的 FLT3 蛋白。
对于特定的细胞模型,必须优化细胞密度以使其处于试剂盒的动态范围内。HTRF 人总 FLT3 检测能有效检测各种表达不同水平 FLT3 蛋白的人细胞模型中的内源性和过表达的野生型 FLT3 或 ITD FLT3 突变体。
HTRF 人总 FLT3 检测与蛋白质印迹法的比较
将转染人 FLT3 的 HEK293 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中,于 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。用 3 mL 补充的 4 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。
使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释,将 16 µL 每种稀释液转移至小体积白色微孔板中,然后加入 4 µL HTRF 人总 FLT3 检测试剂。使用等量的裂解物进行进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。
使用 HTRF 人总 FLT3 检测时,200 个细胞 / 孔就足以检测到显著信号,而使用蛋白质印迹法则需要 1500 个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此,在这些条件下,HTRF 人总 FLT3 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 7.5 倍。
简化通路
FLT3 信号通路
FLT3 是一种 III 类受体酪氨酸激酶,在免疫细胞中表达,通过其配体 FLT3L 激活。与 FLT3L 结合后,FLT3 受体发生二聚化并激活多种通路,包括磷脂酰肌醇 3 - 激酶(PI3K)和 MAPK 通路,从而促进免疫细胞的分裂、增殖和存活。FLT3 通路的失调可能导致无序增殖、未成熟免疫细胞和致癌表型。FLT3 基因的突变会导致受体激酶活性的持续激活,或破坏受体的自身抑制活性。ITD FLT3 突变体不需要 FLT3L 即可激活其下游通路。FLT3 因其在白血病(尤其是急性髓系白血病,AML)发生发展中的作用而广为人知。
- 应用:细胞信号传导
- 品牌:HTRF
- 检测方式:HTRF
- 裂解缓冲液兼容性:1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
- 分子修饰:总(蛋白)
- 产品类别:试剂盒
- 样品体积:16 µL
- 运输条件:干冰运输
- 目标类别:磷酸化蛋白
- 目标物种:人
- 技术:时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)
- 单位规格:500 个检测点